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Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.
Saída de leucócitos de tecidos periféricos para drenagem de linfonodos não é somente crítica para vigilância imune e iniciação mas também contribui para a resolução das respostas do tecido periférico. Embora uma variedade de métodos são usados para quantificar a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos, os mecanismos celulares e moleculares que governam o egresso de contexto-dependente permanecem mal compreendidos. Aqui, descrevemos o uso de photoconversion em situ para análise quantitativa de saída de leucócitos da pele murino e tumores. Photoconversion permite a rotulagem direta de leucócitos residente no tecido cutâneo. Embora a exposição da pele à luz ultravioleta induz local respostas inflamatórias caracterizam por infiltração de leucócitos e leakiness vascular, em uma comparação frente a frente com aplicação transdérmica dos marcadores fluorescentes, photoconversion especificamente rotulado de populações de células dendríticas migratórias e simultaneamente habilitado a quantificação de mieloide e linfoide egresso do microambiente cutâneo e tumores. Os mecanismos de saída de leucócitos mantêm um componente em falta em nossa compreensão da complexidade de leucócitos intratumoral, e, portanto, a aplicação das ferramentas descritas neste documento fornecerá uma visão única da dinâmica do tumor imune microambiente que ambos Só firme estadual e em resposta à terapia.
Respostas imunes de tecido periférico são moldadas não apenas por recrutamento de leucócitos para os locais de inflamação, mas também por mecanismos que regulam sua retenção subsequente. Assim, a imunidade protetora é ditada pela cumulativos mecanismos celulares e moleculares que determinam se um leucócito entra, fica dentro, ou melhor migra do tecido periférico, através de vasos linfáticos. Importante, a propensão para leucócitos sair do tecido através de vasos linfáticos (denominado Egresso) está ligada às suas funções especializadas. Células dendríticas (DC) adquirem comportamento migratório, em resposta a sinais de maturação, levando a transporte do antígeno e apr....
Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Oregon Health & Science University e institucional Cuidado Animal.
1. indução da inflamação e FITC pintura de Mouse Pinna
Primeiro procuramos replicar photoconversion resultados publicados na literatura para avaliar a eficiência e determinar a inflamação associada na pele do rato. O pavilhão auricular orelha foi exposto a 100 mW violeta luz (405 nm) para 3 min como anteriormente descrito33. Único suspensões celulares geradas a partir de pele de orelha ou cervical dLNs imediatamente após a exposição revelaram uma eficiência de conversão de 78% de todos os CD45+ le.......
Embora a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos é fundamental para a iniciação e a resolução de respostas imunes, os mecanismos moleculares que governam o egresso são mal compreendidos. Esta lacuna no conhecimento é em grande parte devido à pronta disponibilidade de ferramentas para a quantificação em vivo. Aqui, descrevemos o uso de ratos de photoconvertible (Kaede-Tg) para quantificar a saída de leucócitos endógeno da pele e tumores e fornecer uma comparação direta de fren.......
Os autores não têm nenhum conflito para divulgar.
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Marcus Bosenberg para fornecer YUMM 1.1 e 1.7 YUMM linhas de melanoma murino e Dr. Deborah J. Fowell para fornecer B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr ratos de acordo com a RIKEN BRC através do Bio-recurso nacional do MEXT, Japão.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
DNase | Roche | 4536282001 | |
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
HBSS | Caisson | HBL06 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
FlowJo v10 Software | FlowJo |
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