Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Genaue Quantifizierung der Transkriptionsfaktor (TF)-DNA-Wechselwirkungen ist wesentlich für das Verständnis der Regulation der Genexpression. Da bestehende Ansätze unter erheblichen Einschränkungen leiden, haben wir eine neue Methode zur Bestimmung der TF-DNA verbindlichen Affinitäten mit hoher Empfindlichkeit auf einer großen Skala entwickelt. Der Test basiert auf dem etablierten Fluoreszenz Anisotropie (FA) Prinzip aber führt wichtige technische Verbesserungen. Zuerst messen wir eine volle FA wettbewerbsfähige Titration Kurve in einem einzigen gut durch den Einbau von TF und Gewebekulturen beschrifteten Referenz DNA in einer porösen Agarose-Gel-Matrix. Unbeschriftete DNA Oligomer ist auf der Oberseite als Konkurrent geladen und durch Diffusion, bildet einen räumlich-zeitlichen Verlauf. Die daraus resultierende FA Steigung wird dann mit einem angepassten Epifluoreszenz Mikroskop Setup ausgelesen. Dieses verbesserte Setup erhöht die Empfindlichkeit der FA Signalerkennung, so dass schwache und starke Bindung zuverlässig quantifiziert werden, auch für Moleküle von ähnlichen Molekulargewichten. Auf diese Weise messen wir eine Titration Kurve pro Bohrloch von Multi-well-Platte, und durch eine passende Prozedur extrahieren wir die absolute Dissoziationskonstante (K-_D) und aktive Proteinkonzentration. Testen Sie alle Einzelpunkt-Mutation Varianten eines bestimmten Konsenses Sequenz binden, können wir die gesamte Bindung Spezifität Landschaft ein TF, in der Regel auf einer einzigen Platte inspizieren. Die resultierende Position Gewicht Matrizen (PWMs) übertreffen die aus anderen Methoden bei der Vorhersage in Vivo TF-Belegung. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Anleitung für die Umsetzung der HiP-FA auf einem konventionellen automatisierten fluoreszierende Mikroskop und die Daten-Analyse-Pipeline.