Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Transkripsiyon faktörü (TF) doğru miktar-DNA etkileşimleri Gen ifadesinin düzenlenmesinde anlamak için gerekli. Varolan yaklaşımları önemli kısıtlamalar acı beri TF-DNA bağlayıcı benzeşim büyük ölçüde yüksek hassasiyetle belirlemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Tahlil kurulan floresans anizotropi (FA) ilkesine dayanır ama önemli teknik geliştirmeler içerir. İlk olarak, TF ve fluorescently etiketli başvurusu DNA gözenekli özel jel Matristeki dahil ederek tek iyi bir tam SK rekabetçi titrasyon eğrisi ölçüyoruz. Etiketlenmemiş DNA oligomer üstünde belgili tanımlık tepe rakip olarak yüklenir ve difüzyon spatio-zamansal bir degrade oluşturur. Elde edilen SK geçişin ardından özelleştirilmiş epifluorescence mikroskop kurulumu kullanarak okunur. Bu gelişmiş kurulum büyük FA sinyal algılama, güvenilir, hatta benzer moleküler ağırlık moleküller için sayısal güçlü ve zayıf bağlamaya izin vererek hassasiyeti artırır. Bu şekilde çok iyi bir tabak kuyu başına bir titrasyon eğrisi ölçebilir ve uygun yordam, biz mutlak ayrışma sabiti (K_D) ve aktif protein konsantrasyonu ayıklayabilirsiniz. Tüm tek nokta mutasyon değişik sıralı bağlama belirli bir fikir birliği test ederek, genellikle tek bir plaka üzerinde bir TF tüm bağlamayı özgüllük manzara anket. Elde edilen pozisyon ağırlık matrisleri (PWMs) bu vivo içinde TF doluluk öngörmede diğer yöntemleri elde daha iyi performans. Burada, geleneksel otomatik floresan mikroskop ve veri analiz boru hattı üzerinde HiP-FA uygulamak için ayrıntılı bir rehber mevcut.