crispr 介导的人类真菌病原体白色念珠菌基因组编辑

该方法描述了对二倍体人类真菌病原体白色念珠菌的有效的 crispr 介导的基因组编辑。crispr 介导的白色念珠菌基因组编辑需要 cas9、指导 rna 和修复模板。表达酵母密码子优化 cas9 (casas9) 的质粒已经产生。将直接从 pam 站点 (ngg) 上游的引导序列克隆到 cas9 表达向量中。然后通过引物延伸在体外进行修复模板。修复模板和载体的转化为白色念珠菌导致基因组编辑。根据所使用的修复模板, 调查人员可以引入核苷酸的变化、插入或删除。由于白色念珠菌是二倍体, 突变是在基因的两个等位基因中做出的, 前提是 a 和 b 等位基因不携带干扰指南靶向或修复模板整合的 snps。如果所有家庭成员中都存在适当的保守序列, 则可以并行编辑多基因家族。所描述的白色白色crispr 系统是由 frt 站点和编码翻转。诱导翻转酶后, 抗生素标记 (casas9) 和引导 rna 将从基因组中删除。这使得调查员能够对基因组进行后续编辑。白色念珠菌crispr 是一种强大的真菌基因工程工具, 对所述协议稍作修改, 可以修改其他真菌物种, 包括刺五加、n. castellii 和酿酒酵母。