הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

Summary

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

Abstract

ניתוח של חלבון ביטוי glioma רלוונטי עבור מספר היבטים במחקר של הפתולוגיה שלו. חלבונים רבים תוארו גם סמנים ביולוגיים עם יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. ניתוחים אלה של סמנים שימושיים גם לאפיין הגידול neurospheres (NS) המופקים glioma חולים ומודלים glioma. הגידול NS מספקות מודל ערך במבחנה כדי להעריך את תכונות שונות של הגידול שממנו הם נגזרים, ניתן באופן מדויק יותר מראה glioma ביולוגיה. כאן נתאר שיטת מפורט לניתוח סמנים סרטניים NS באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) על גידול פרפין-מוטבע NS.

Introduction

Gliomas הם גידולים מוצקים העיקרי של מערכת העצבים המרכזית מסווגים לפי המאפיינים שלהם פנוטיפי ו genotypic על פי ארגון הבריאות העולמי ה-¹. סיווג זה משלבת נוכחות או היעדרות של מוטציות הנהג, אשר מייצגים מקור אטרקטיבי של סמנים ביולוגיים². סמנים ביולוגיים הן תכונות ביולוגיות ולהשוואה הערכה לציון תהליכים נורמליים ופתולוגיים, כמו גם תרופתי התגובות התערבות טיפולית³. סמנים ביולוגיים ניתן להבחין ב גידול רקמות ותאים שמקורם glioma, המאפשרת אפיון ביולוגי שלו בהיבטים שונים. כמה דוגמאות של סמנים ביולוגיים glioma כוללים מוטציה isocitrate דהידרוגנאז 1 (IDH1), אנזים מוטציה האופייניים gliomas נמוך בכיתה הקשורים עם פרו....

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.

1. דור של המוח גידול Neurospheres נגזר דגם העכבר

1. לפני ההליך לנתיחה, להכין תאי גזע עצביים מדיה (Media המועצה לבטחון לאומי: DMEM/F12 עם תוספת x B27 1, 1 השלמה x N2, 1 x normocin 1 x אנטיביוטיקה/antimycotic בתוספת האנושי רקומביננטי EGF ו- basic-FGF בריכוזים של 20 ng/mL כל). למלא את צינור 1.5 מ ל 300 µL של המועצה לבטחון לאומי מדיה ושריין מאוחר יותר.
2. בחר עכבר עם גידול גדול.
   הערה: גודל הגידול ניתן יהיה פיקוח על ידי ביולומינסנציה אם פלסמיד או הוירוס מוזרק מקודד luciferin. בדרך כלל, גידול גדול יש ביולומינסנציה של > 10

תוצאות

לעקוב אחר התפתחות גידולים ולהעריך אם הגידול הגיע הגודל הדרוש ליצירת NS, ניתחנו את לומינסנציה הנפלטת גידולים באמצעות ביולומינסנציה. פעולה זו מאפשרת לימוד יעילות התמרה חושית הגורים, התקדמות הגידול ע י האות הפריה חוץ גופית של לוציפראז (איור 1א' ו-

Discussion

במאמר זה, אנחנו פירוט שיטה לשחזור רב-תכליתי לביצוע אימונוהיסטוכימיה על glioma פרפין-מוטבע NS, המקיימות המבנה 3D האופיינית של תאים סרטניים גדל המוח בתוך באתרו. טכניקה זו יש את היתרונות הבאים לעומת באמצעות תאי ציפוי זכוכית או משטחי פלסטיק: אני) שימור המבנה התלת-ממד של NS; ii) הימנעות של מתח התא ה.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse