Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Nöral kök ve progenitor hücreleri (NSPCs) beynin karmaşık yapıları ve fonksiyonları için hücresel temelidir. Onlar vivo özel nişler bulunmaktadır ve izole edilebilir ve in vitrogenişletilmiş , beyin hasarı onarmak için hücre nakli için önemli bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Ancak, NSPCs heterojen ve açıkça moleküler düzeyde tanımlanmış ya da belirli hücre yüzey belirteçleri eksikliği nedeniyle saflaşmış değildir. Daha önce bildirilen protokol, primer NSPC'lerin yüzey siyaloglycoproteom'unun belirlenmesi için nöral-endotel ortak kültür sistemini metabolik glikan etiketleme yöntemiyle birleştirir. NSPC-endotel ortak kültür sistemi kendi kendine yenileme ve birincil NSPCCs in vitrogenişlemesi sağlar , NSPCCs yeterli sayıda üreten. Kültürlü NSPCs Sialoglycans ile doğal olmayan bir sialic asit metabolik muhabir kullanılarak etiketlenir biyoortogononal fonksiyonel gruplar. Kendi kendini yenileyen NSPC'lerden siyaloglycoproteome'yi karşılayarak endotel ortak kültüründe genişleyen ve nöral kültürü farklılaştıran bir membran proteinlerinin listesini tanımlıyoruz. Ayrıntılı olarak, protokol içerir: 1) bir NSPC-endotel ortak kültür ve NSPC ayırt edici kültür kurulumu; 2) azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz) ile etiketleme; ve 3) kitle spektrometresi analizi için nöral kültürden nöral kültür veya protein çıkarma fiksasyonu sonra görüntüleme için modifiye sialoglycan biotin konjugasyonu. Daha sonra, NSPC ile zenginleştirilmiş yüzey işaretleyici adayları, hem genişletilmiş NSPC hem de farklılaştırılmış sinir kültürlerinden kütle spektrometresi verilerinin karşılaştırmalı analizi ile seçilir. Bu protokol, başlangıç maddelerinde düşük miktarda ki membran proteinlerinin tanımlanması nda son derece hassastır ve uygun modifikasyonlarla diğer sistemlerde marker keşfine uygulanabilir.