Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

Die leucinreiche Wiederholungskinase 2 (LRRK2) ist das am häufigsten mutierte Gen bei der erblichen Parkinson-Krankheit (PD) und alle pathogenen LRRK2-Mutationen führen zu einer Hyperaktivierung seiner Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir einen einfachen und robusten Test zur Quantifizierung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen, indem wir die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung eines seiner physiologischen Substrate, Rab10 bei Threonin 73, messen. Die beschriebene Immunoblotting-Analyse erfordert einen vollständig selektiven und phosphospezifischen Antikörper, der das von LRRK2 phosphorylierte Rab10 Thr73-Epitop erkennt, wie z. B. den monoklonalen Antikörper MJFF-pRab10 Kaninchen. Es verwendet menschliche periphere Blutneutrophilen, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist und Neutrophile ein reichlicher und homogener Bestandteil sind. Wichtig ist, dass Neutrophile relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 und Rab10 ausdrücken. Ein potenzieller Nachteil von Neutrophilen ist ihre hohe intrinsische Serinproteaseaktivität, die die Verwendung sehr potenter Proteasehemmer wie dem Organophosphor-Neurotoxin Diisopropylfluorphosphat (DIFP) als Teil des Lysepuffers erfordert. Dennoch sind Neutrophile eine wertvolle Ressource für die Erforschung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität in vivo und sollten für die Aufnahme in PD-Biorepository-Sammlungen in Betracht gezogen werden.