Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Ferramentas de entrega de gene com base no vírus adeno-associado (AAVs) são uma escolha popular para a entrega de transgenes para o sistema nervoso central (CNS), incluindo aplicações da terapia de gene. Vetores AAV são não se replicam, capaz de infectar células de divisão e não dividindo e fornecer a longo prazo expressão do transgene. Importante, alguns serotipos, tais como o PHP recém descrito. B, pode cruzar a sangue-cérebro-barreira (BBB) em modelos animais, após o parto sistêmico. Vetores de vírus adeno-associados podem ser eficientemente produzidos em laboratório. No entanto, robustos e reprodutíveis protocolos são necessários para obter vetores AAV com níveis suficientes de pureza e valores de concentração altas o suficiente para aplicações em vivo . Este protocolo descreve uma estratégia eficiente e reprodutível para produção de vetor AAV, baseada numa estratégia iodixanol gradiente de purificação. O método de purificação iodixanol é adequado para a obtenção de lotes de vetores AAV alta-título de alta pureza, quando comparado a outros métodos de purificação. Além disso, o protocolo é geralmente mais rápido que outros métodos descritos atualmente. Além disso, um quantitativo polymerase chain reação (qPCR)-estratégia baseada é descrito por uma determinação rápida e precisa do título o vetor, bem como uma método de coloração de prata determinar a pureza do lote vector. Finalmente, resultados representativos da entrega do gene ao SNC, seguindo a administração sistémica de AAV-PHP. B, são apresentados. Tais resultados devem ser possíveis em todos os laboratórios usando os protocolos descritos neste artigo.