Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Herramientas de entrega genética basadas en virus adeno-asociados (AAVs) son una opción popular para la entrega de los transgenes a sistema nervioso central (SNC), incluyendo aplicaciones de terapia génica. Vectores AAV son capaces de infectar células divisorias y no dividir y dar expresión de transgenes a largo plazo, no replicar. Importantemente, algunos serotipos, como el PHP nuevamente descrito. B, puede cruzar la sangre-barrera hematoencefálica (BBB) en modelos animales, después de la entrega sistémica. Vectores AAV se pueden producir eficientemente en el laboratorio. Sin embargo, protocolos robustos y reproducibles se requieren para obtener los vectores AAV con suficientes niveles de pureza y los valores de titulación lo suficientemente altos como para aplicaciones en vivo . Este protocolo describe una estrategia eficiente y reproducible para la producción de vectores AAV, basada en una estrategia de purificación gradiente iodixanol. El método de purificación de iodixanol es adecuado para la obtención de lotes de los vectores AAV alto-título de alta pureza, en comparación con otros métodos de purificación. Además, el protocolo es generalmente más rápido que otros métodos descritos en la actualidad. Además, una cuantitativa de polimerasa de la cadena de reacción (qPCR)-estrategia por turnos se describe para que una determinación rápida y precisa de la titulación de vectores, así como un método de tinción de plata determinar la pureza del lote de vector. Finalmente, resultados representativos de la entrega del gene para el CNS, después de la administración sistémica de AAV-PHP. B, se presentan. Estos resultados deberían ser posibles en todos los laboratorios utilizando los protocolos descritos en este artículo.