Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gen leveransverktyg baserat på adeno-associerade virus (AAVs) är ett populärt val för leverans av transgener till det centrala nervsystemet (CNS), inklusive gen terapi program. AAV vektorer är icke-replikering, kan infektera både dela och icke-dela celler och ge långsiktiga transgenens uttryck. Ännu viktigare, vissa serotyper, såsom nyligen beskriven PHP. B, kan korsa blod-hjärna-barriären (BBB) i djurmodeller, efter systemisk leverans. AAV vektorer kan produceras effektivt i laboratoriet. Robust och reproducerbara protokoll krävs dock att erhålla AAV vektorer med tillräcklig renhet nivåer och antikroppnivåns värden tillräckligt hög för i vivo applikationer. Det här protokollet beskriver en effektiv och reproducerbara strategi för AAV vektor produktion, baserat på en iodixanol gradient rening strategi. Iodixanol rening metoden är lämplig för att erhålla partier av hög-titer AAV vektorer av hög renhet, jämfört med andra reningsmetoder. Protokollet är dessutom allmänt snabbare än andra metoder som för närvarande beskrivs. Dessutom en kvantitativ polymerasen kedjar reaktion (qPCR)-baserad strategi beskrivs för en snabb och noggrann bestämning av vektor titern, liksom silver färgning metod att bestämma renheten av vektor batchen. Slutligen, representativa resultat gen leverans till CNS, efter systemisk administrering av AAV-PHP. B, presenteras. Sådana resultat bör vara möjligt i alla laboratorier med de protokoll som beskrivs i denna artikel.