ويشكر المؤلفون ProMab التكنولوجيات الحيوية و اسيا والعلوم الحيوية لتوفير الكواشف والاداات المستخدمة في هذه الدراسة.

1. جيل من لينتيفيروس ترميز السيارات
ملاحظه: بمجرد الانتهاء من البناء الخاصة بالخلايا T-خليه البلازما (CD47 وغيرها) ، يتم إنشاء لينتيفيرال CARs من قبل الإجراءات القياسية ، وذلك باستخدام 293 FT الخلايا ، ومزيج التعبئة والتغليف لينتيفيرال ، ووكلاء ترانسكشن (انظر جدول المواد) كما هو موضح29. وفي وقت لاحق ، استخدم النسخ العكسية الكمية تفاعل البلمره سلسله (RT-PCR) عده والدورية الحرارية (انظر جدول المواد) لتحديد عيار الفيروس عن طريق قياس المبلغ لينتيفيرال RNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ومن المهم ان تنفذ جميع الإجراءات اللينتيفيراله بدقه وفقا لمتطلبات السلامة.
<ol><li>بذور 15 × 106 خلايا HEK293FT في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (dmem) واحتضان الخلايا بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية في 1 150 الصحن مم داخل مرطب 5 ٪ CO2 حاضنه.</li>
	<li>اعداد أنابيب 2 15 mL مع مجمع ترانسفيكشن. الأنبوب الأول يحتوي علي لينتيفيرال الحمض النووي الحمضية المتجهة (5 ميكروغرام) ومزيج التعبئة والتغليف لينتيفيرال (22.5 ميكروغرام) في 2.5 مل من محلول تخفيف العدوى. الأنبوب الثاني يحتوي 82.5 μL من الكاشف ترانسفيكشن في 2.5 mL من محلول تخفيف التحويل (انظر جدول المواد).</li>
	<li>Pipet محتويات أنبوب 1 في أنبوب 2 ، واحتضان الخليط في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.</li>
	<li>نقل محتويات أنبوب قطره إلى طبق من الخلايا HEK293FT واحتضان العينة بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية في ترطيب 5 ٪ CO2 حاضنه.</li>
	<li>في اليوم التالي, استبدال المتوسطة القائمة مع 19 مل من المتوسطة الثقافة DMEM الطازجة والاستمرار في احتضان الخلايا بين عشيه وضحيها داخل ترطيب 5% CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية.</li>
	<li>نقل المتوسطة من الطبق إلى أنبوب الطرد المركزي 50 mL. الحفاظ علي أنبوب مع المتوسطة التي تحتوي علي الفيروس في الثلاجة.</li>
	<li>كرر الاجراء المذكور أعلاه ، أضافه DMEM الطازجة وجمعها مره أخرى بعد 1 يوم.</li>
	<li>الجمع بين مجموعتين من وسائل الاعلام في أنبوب الطرد المركزي واحد. نابذ الأنبوب في 2,000 x g لمده 30 دقيقه عند 4 درجه مئوية.</li>
	<li>نقل معظم لينتيفيروس المحتوية علي السوبر لأنبوب الطرد المركزي ultraclear. ترك حجم الحد الأدنى ، حوالي 1 مل ، من ماده طافي لتجنب إزعاج بيليه التي قد تحتوي علي الخلايا و/أو الحطام.</li>
	<li>[اولترنتريفوج] ال أعلاه يوضح [سوبرننت] في 110,000 [غ] [ ز ] ل 100 [مين] في 4 [ك.].</li>
	<li>أزاله ماده طافي بعناية وبلطف أضافه 100 μl من المتوسطة dmem إلى بيليه الفيروس في أسفل الأنبوب. اترك الأنبوب علي الثلج لمده 15 دقيقه. اخلط المحلول برفق والمحلول اللينتيفيروس في أنابيب معقمه مبرده مسبقا. تخزين هذه الفيروسات الأسهم الأنابيب في 80 درجه مئوية الفريزر.</li>
	<li>استخدام الكمية RT-PCR عده لتحديد عيار من لينتيفيروس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، الذي مقتطفات والتدابير لينتيفيرال RNA.</li>
</ol>2. توليد وتوسيع خلايا السيارات T
<ol><li>تنشيط سابقا الإنسان المجمدة PBMCs (حوالي 1 × 106 إلى 2 × 106 خلايا) في 1 مل من السيارات المتوسطة تي الخلية مع عدد متساو من CD3/CD28 المغلفة الخرز (انظر جدول المواد) واحتضان الخلايا في 37 درجه مئوية في ترطيب 5 ٪ CO2 حاضنه لمده 24 ساعة.</li>
	<li>ذوبان الجليد من الأسهم لينتيفيروس علي الثلج.</li>
	<li>أضافه 1 μL من محول تعزيز عامل في البئر مع الخلايا ومزيج.</li>
	<li>أضافه لينتيفيروس إلى الخلايا في تعدد العدوى (موي) من 5:1 وتخلط برفق. في اليوم التالي ، كرر هذه الخطوة (24 ساعة بعد المحول الأول).</li>
	<li>مراقبه نمو الخلايا T كل 2-3 يوما. أضافه المزيد من السيارات الطازجة T-خليه المتوسطة للحفاظ علي الخلايا في كثافة من 1 × 106 إلى 2 × 106 خلايا/مل.</li>
	<li>تجميد الخلايا T السيارات مع بروتوكول قياسي باستخدام محلول تجميد (انظر جدول المواد).</li>
	<li>ذوبان الخلايا T السيارات باستخدام طريقه قياسيه والزراعة المسبقة لهم في المتوسطة سيارة T-خليه لحوالي ~ 2-4 h مع IL-2 (300 وحدات/مل) قبل تطبيقها علي الفحص.</li>
</ol>3. الكشف عن التعبير عن السيارات عن طريق تدفق الخلوي
<ol><li>نقل 3 × 105 الخلايا السيارات t والخلايا غير محوله إلى اثنين منفصلة 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير.</li>
	<li>الطرد المركزي الأنابيب في 300 x g لمده 2 دقيقه وأعاده تعليق الخلايا في 200 μl من الفرز الخلية المنشطة مضان (facs) العازلة التي تحتوي علي 1 ٪ مصل الإنسان.</li>
	<li>Pipet 100 μL من محلول الخلية إلى اثنين من أنابيب البوليسترين 5 مل FACS والحفاظ علي أنابيب علي الجليد لمده 5 دقائق.</li>
	<li>أضافه 1 μL من الماعز بيوتينيلاتيد المضادة للماوس F (ab ')2 إلى أنبوب واحد من كل نوع الخلية. ثم ، أضافه 2 μL من PE المسمي مكافحه العلامة المضادة (انظر جدول المواد) إلى أنبوب آخر من كل نوع الخلية. تخلط جيدا واحتضان لهم علي الجليد لمده 30 دقيقه.</li>
	<li>غسل الخلايا مع 3 مل من العازلة FACS في كل أنبوب والطرد المركزي أنابيب في 300 x g لمده 5 دقائق; تجاهل الديدان والدوامة لفتره وجيزة جدا أو يهز الأنابيب لفتره وجيزة لأعاده تعليق الخلايا في السائل المتبقية.</li>
	<li>أضافه 2 μL من APC المضادة لCD3 و 2 μL من 7-عاد حل الأضداد (انظر جدول المواد) لكل أنبوب. في أنبوب من الخلايا الملونة مع المضادة-F (ab ')2 ab ، أضافه 1 μl من العلامات التي تحمل اسمها العقديات. مزيج لفتره وجيزة واحتضان الأنابيب علي الجليد لمده 30 دقيقه أخرى.</li>
	<li>استخدام المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا مره أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.5 وأضافه 200 μL اضافيه من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب.</li>
	<li>استخدام التدفق الخلوي لتحليل الخلايا عن طريق الصب الاولي علي الخلايا T في مبعثر إلى الامام مقابل الجانب مبعثر المؤامرة ومن ثم النابضة علي الخلايا الحية (7-عاد-سلبي) في CD3 مقابل 7-عاد مؤامرة. الخطوة الاخيره هي لتحليل مكافحه العلامة ، ومكافحه ScFv أو المضادة-F (ab ')2 مقابل CD3.</li>
</ol>4. في الوقت الحقيقي اختبار قوه السيتولسيس
ملاحظه: اجراء فحص RTCA وفقا للشروط الموصي بها الشركة المصنعة. باختصار ، اللوحة الاولي الخلايا المستهدفة في الآبار من اللوحة الكترونيه ، تليها أضافه خلايا السيارات T في اليوم التالي. يتم رصد النشاط الخلوي للخلايا T السيارات ضد الخلايا المستهدفة في الوقت الحقيقي. وتستخدم خلايا t والخلايا T وهميه محوله (الخلايا الوهمية السيارات T) كعناصر التحكم الخلية السلبية المستجيب. يصف البروتوكول التالي في المختبر في الوقت الحقيقي فحص فاعليه الخلايا السرطانية الملتصقة.
<ol><li>أضافه 100 μL من الخلية الهدف الثقافة المتوسطة لكل بئر من Xcelligens E-لوحه ، وضع لوحه داخل الصك Xcelligens ، واتخاذ القراءة الخلفية. ثم نقل اللوحة الكترونيه إلى غطاء لزراعه الانسجه لبذر الخلايا.</li>
	<li>استخدام بروتوكول قياسي إلى ترسينسيزي الخلايا السرطانية الهدف من جهاز الثقافة. ثم نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأضافه الثقافة الطازجة المتوسطة ، تصل إلى 15 مل. بيليه الخلايا بواسطة طرد لمده 5 دقائق في 200 x g. تجاهل سوبرناتانت ، أضافه 5 مل من المتوسطة الطازجة ، واستخدام ماصه المصلية لأعاده التعليق بلطف بيليه الخلية. احسب كثافة الخلايا الحية باستخدام مقياس الكريات الدموية والمجهر.</li>
	<li>ضبط كثافة الخلية بشكل مناسب ومن ثم أضافه 100 L من تعليق الخلية إلى كل بئر من اللوحة الكترونيه. رقم الخلية الهدف عاده حوالي 10,000 خلايا/جيدا لخطوط الخلايا الملتصقة (BxPC3 ، CD19 ، و SKOV3) ، أو خلايا 30,000/جيدا لخلايا التعليق مثل راجي (انظر أدناه للحصول علي التفاصيل المتعلقة بالآبار precoating مع الأجسام المضادة من أجل حبل الخلايا السرطانية السائلة).</li>
	<li>تتوازن اللوحة E في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه للسماح للخلايا لتسويه بالتساوي علي الجزء السفلي من البئر (وهذا أمر بالغ الاهميه ؛ لا تخطي هذه الخطوة).</li>
	<li>ضع اللوحة الكترونيه في أداه xCELLigence داخل حاضنه ثقافة الخلية وأبدا في قياس المقاومة ، وعرضها كمؤشر خليه مقابل الوقت ، تلقائيا كل 15 دقيقه.</li>
	<li>في اليوم التالي ، واعداد خلايا السيارات T المستجيب. تاكد من اعداد الضوابط المناسبة (علي سبيل المثال ، الخلايا الوهمية للسيارة T ، خلايا t التحكم غير محوله ، و/أو غير ذات صله الخلايا T السيارات) في وقت مبكر لضمان جميع الخلايا جاهزه في نفس الوقت. ضبط الخلايا المستجيب وخلايا التحكم إلى الكثافة المناسبة ، واعداد التخفيفات التسلسلية لضمان النسب E:T المطلوبة سيتحقق عند 100 μL من تعليق الخلية المستجيب يضاف إلى كل بئر في الخطوة 9.</li>
	<li>إيقاف الحصول علي البيانات بشكل مؤقت وإحضار اللوحة الكترونيه من الحاضنة إلى غطاء لثقافة الخلية.</li>
	<li>أزاله 100 μL من المتوسطة من كل بئر. كميه المتوسطة المتبقية في كل بئر هو الآن 100 μL.</li>
	<li>أضافه 100 μL من الخلايا العاكسة المخففة المتسلسلة السيارات T أو خلايا التحكم الأخرى (اي وهميه الخلايا T السيارات) لتحقيق نسب E:T المطلوب.</li>
	<li>تتوازن اللوحة الكترونيه في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه للسماح للخلايا العاكسة بالاستقرار ، ثم ضع اللوحة الكترونيه مره أخرى في أداه xCELLigence. استئناف الحصول علي البيانات.</li>
	<li>إذا رغبت في ذلك ، في النقاط الزمنيه الرئيسية يمكن إيقاف الحصول علي البيانات xCELLigence مؤقتا وأزاله لوحه من أجل جمع عينات صغيره ليتم تحليلها عن طريق المقايسات المتعامدة (اي قياس إنتاج السايسيسين من قبل اليسا أو تدفق الخلوي).</li>
	<li>في تجربه الخلية T-CD3 السيارة ، وقياس العائد INFγ مع مجموعه اليسا (اتبع تعليمات الشركة المصنعة ؛ انظر جدول المواد). ملاحظه بشان استخدام السرطانات السائلة: لاختبار الخلايا السرطانية الدموية غير الملتصقة ، قبل أضافه الخلايا ، يتم أولا المغلفة ابار اللوحة الكترونيه مع الأجسام المضادة التي هي محدده لمستضد التي يتم التعبير عنها علي سطح الخلايا السرطانية. لخط خليه راجي B يتم استخدام كاشف الربط علي أساس مضاد لCD40 (انظر السائل الورم قتل الفحص عده في جدول المواد). وفيما يلي اجراء لطلاء لوحه:</li>
	<li>تمييع كاشف الربط (المضادة لCD40) مع الربط العازلة إلى تركيز 4 ميكروغرام/مل.</li>
	<li>العمل داخل غطاء النسيج الثقافي ، أضافه 50 μL من كاشف الربط المخفف إلى كل بئر من اللوحة الكترونيه. اترك اللوحة الكترونيه في درجه حرارة الغرفة أو في حاضنه 37 درجه مئوية لمده 3 ساعات.</li>
	<li>أزاله كاشف الربط وغسل اللوحة الكترونيه علي الأقل 2x مع غسل العازلة. عند هذه النقطة ، اللوحة الكترونيه جاهزه لبذر الخلايا المستهدفة راجي (30,000 خلايا/بئر).</li>
	<li>متابعه الخطوة 4.1 (أعلاه) لتنفيذ بقية الاجراء.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+Therapy:+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy.">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>June, C. H., O&#8217;Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>. FDA approval brings first gene therapy to the United States Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017)</li><li>. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017)</li><li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China.">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology &#38; Oncology. 10 (1), 166 (2017).</li><li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy.">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li><li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells.">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li><li>. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate Available from: <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017)</li><li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf.">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li><li>D&#8217;Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &#38; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors.">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li><li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric-antigen+receptor+T+(CAR-T)+cell+therapy+for+solid+tumors:+challenges+and+opportunities.">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors.">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li><li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy.">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li><li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis.">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li><li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+chromium-51+release,+cell-mediated+cytotoxicity+assay:+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells.">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li><li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry.">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).</li><li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse.">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Unit+7:+51Cr+release+assay+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+(ADCC).">Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).</a> Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements.">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li><li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays.">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li><li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability.">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li><li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies:+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels.">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering &#38; Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li><li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth.">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li><li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer.">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation.">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li><li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system.">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).</li><li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells.">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li><li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape.">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules.">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).</li><li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47/SIRPalpha+axis.">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li><li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD47:+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy.">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li><li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine,+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+(P4455).">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer.">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy.">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening.">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).</li><li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technology+and+patient+cells:+from+early+drug+development+to+precision+medicine.">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li></ol>

المؤلفين اجراء البحوث في التنمية الخلية T-الخلايا والاختبارات قوه المرتبطة بها والتي هي المصالح التجارية للتكنولوجيا الحيوية ProMab واسيا والعلوم الحيوية ، علي التوالي. غير ان هذا لا يغير من التزام المؤلفين بمهمة الشركة المتمثلة في زيادة نشر المعرفة العلمية. وقد تم استعراض شروط هذا المنشور والموافقة عليها من قبل ProMab التكنولوجيات الحيوية واسيا والعلوم الحيوية وفقا لسياستها البحثية.

مستقبلات مستضد chimeric هي البروتينات متعددة المجالات التي تتالف من جزء متغير أحاديه الخلية سلسله واحده (scfv المنطقة), منطقه مفصليه, منطقه الغشاء الغشائي, ومجال سيتوبلازمي تتالف من المجالات الإشارات TCR والمجالات كوستيمولاتوري اضافيه من مستقبلات مثل CD28 و OX4011,40. لتصميم السيارات الامنه والانتقائية والفعالة ، من الضروري ان يتم اختبار الانحرافات المختلفة في تصميم السيارات بدقه باستخدام فحوصات القوه الانبوبيه ، وفي النهاية ، نماذج حيوانيه. في هذه الدراسة ، قمنا بتوفير بروتوكول وسير عمل لكيفيه اختبار قوه في الوقت الحقيقي في المختبر يمكن ان تسترشد تصميم السيارات الفعالة.
في تصميم اي نوع من اختبار قوه ، ولا سيما لأغراض التصنيع ، فمن المحتم ان تكون حساسة وقويه ومتسقة ، وأقرب إلى اليه العمل ممكن16،17،41. تم تصميم اختبار الفعالية في الوقت الحقيقي الموصوف هنا لقياس النشاط لحل للخلية سيارة T مباشره بدلا من استخدام علامة بديله مثل الإفراج السايسيسيني. الأهم من ذلك ، فان الفحص لا يتطلب اي مكونات اضافيه مثل الاصباغ أو الكواشف بخلاف لوحه الفحص (اللوحة الكترونيه) والوسائط الموصي بها للحفاظ علي الخلايا. بالاضافه إلى ذلك ، فان الفحص حساس بشكل رائع ويوفر بيانات عاليه الاستنساخ مقارنه بالمقايسات الأخرى المستندة إلى التسمية42،43،44. وعلاوة علي ذلك ، فان فحص Xcelligenis قابل لاستخدام نسب منخفضه جدا من المستجيب إلى الهدف التي تعتبر مثاليه لتقييم تحلل الخلايا المحدد.
من أجل إظهار المرونة والفائدة من نظام اكسسيليليجانس ، وقد ركزنا علي نوعين الورم ، وهي أورام الأصل الدموي والأورام الصلبة. من أجل تقييم فاعليه خلايا السيارات الموجهة CD22 ، تم المربوطة خلايا راجي (اي خط خلايا الغدد الليمفاوية B) إلى اللوحات الكترونيه باستخدام الأجسام المضادة لCD40. الربط بين خلايا راجي إلى أسفل اللوحات الكترونيه ينتج عنه اشاره مقاومه تعكس قابليه وعدد خلايا الراجي في البئر. بعد أضافه خلايا CD22 ، يتم قتل خلايا الراجي بشكل انتقائي بطريقه تعتمد علي الوقت والأثر ، وتتوج بانخفاض يعتمد علي الوقت في اشاره المقاومة. الانخفاض في المقاومة يدل علي التحلل أو فقدان القدرة علي البقاء لخلايا الراجي17. يمكن توسيع هذا النهج الربط الانتقائي باستخدام الأجسام المضادة لخطوط الخلايا السرطانية السائلة الأخرى. استراتيجية بديله لاستخدام خطوط الخلايا السرطانية من أصل الدم هو استخدام الخلايا السرطانية الملتصقة التي تم هندستها للتعبير بثبات عن مستضدات الورم ، مثل CD19 المعرب عنها في الخلايا هيلا. وميزه هذا النهج هي ان خلايا هيلا الابويه متاحه بسهوله ويمكن استخدامها كعنصر تحكم سلبي لتحديد الخصوصية. وقد تم بالفعل التحقق من صحة مثل هذا النهج مع الخلايا CD22 vs. cho و CHO-BCMAs مقابل الخلايا تشو29. باستخدام هذه النهج المختلفة ، يمكن اختبار الخلية T-تصميم وفعالية بسهوله. الفحص [اكسسلليجونس] بالفطرة مرنه, وفحص شروط يستطيع كنت عدلت [أين وردر تو] بشكل اقصي تقريبيه [فسولوجكل] شروط.
أحد المزايا الرئيسية لفحص الفاعلية الذي وصفناه هنا هو انه فحص وظيفي بسيط ويمكن استخدامه بالتزامن مع تقنيات الهندسة الوراثية لتصميم السيارات المثلي والفعالة بطريقه عاليه الانتاجيه. كما هو موضح هنا لخلايا السيارات T مصممه لاستهداف الخلايا السرطانية الايجابيه EGFR ، يمكن استخدام الفحص لتقييم النشاط النسبي لمختلف بنيات السيارات/المسوخ. علي سبيل المثال ، أظهرنا انه عندما يكون المجال gitr المنبع من المجال CD3 فانه يظهر نشاط لحل اقوي بكثير من عندما يقع في المصب من المجال CD3.
علي الرغم من انه لا يرتبط تماما مع في الجسم الطبيعي النشاط الخلية T, في المختبر الإفراج السايسيسيني وقد استخدمت تاريخيا كمقياس للقوه الخلية T قوه. علي الرغم من ان اختبار الفاعلية القائم علي xCELLigence الموصوف هنا يمكن استخدامه لتقييم العلاجات القائمة علي الخلايا اثناء التصنيع أو قبل إصداره للتطبيقات السريرية ، فان مدي ارتباط هذه النتائج بفعالية الجسم الحيوي لم يتم بعد المنشاه. في فعاليه الجسم الحيوي يعتمد علي مجموعه من العوامل والمتغيرات التي لا يمكن تلخيصها في الفحص في المختبر. وتشمل هذه المتغيرات: الموجه من خلايا السيارات T إلى موقع الورم ، وتحفيز وتفعيل الخلية T السيارة وقدرتها علي الاستمرار داخل المريض ، والبيئة المجهرية الورم. مع مزيد من الصقل ، قد يكون فحص xCELLigence قادرا علي نمذجة بعض هذه العمليات المعقدة في المختبر.
ينطبق البروتوكول المقدم هنا علي معظم خطوط الخلايا السرطانية الملتصقة وبعض خطوط الخلايا السرطانية السائلة. العينات السريرية مثل الخلايا السرطانية الاوليه ، ومع ذلك ، تحتاج إلى مزيد من الاختبار والأمثل بسبب تعقيد أنواع ومراحل الورم. ومن المؤكد ان من الجدير بالذكر ان نظام الفحص قوه في المختبر وصفها هنا يستخدم خطوط الخلايا السرطانية فقط لتعكس النشاط المحتمل للخلايا السيارات T. الوضع الحقيقي الورم داخل جسم الإنسان هو أكثر تعقيدا بكثير ، وخصوصا عندما يتم استهداف الورم الصلبة ، وذلك بسبب بيئة الورم الديناميكية والتنمية. ولذلك ، فان نتيجة تقييم قوه قد لا تترجم بشكل جيد للغاية في الفعالية السريرية للخلايا السيارات T اختبارها.
وباختصار ، فان منصة xCELLigence المقدمة علي أساس المقاومة تسمح بالرصد الخالي من التسمية لقتل الخلايا لفتره طويلة من الزمن ، اي ما يصل إلى 10 أيام. وهذه القدرة علي هذا النطاق الزمني الطويل لجمع البيانات تفرق بين التكنولوجيا والمقايسات الأخرى المستخدمة حاليا والتي تتطلب اعداد نسخ متماثلة تجريبية متعددة لجمع النقاط الزمنيه والتلاعب بالعينات المضنية. وعلاوة علي ذلك ، فان الحد الأدنى من مساهمه الخلايا المناعية المستجيبة يبسط تحليل البيانات. يمكن للبرنامج معالجه البيانات تلقائيا وتوليد المعلمات المفيدة مثل النسبة المئوية للسيتولسيس ، KT50 ، الخ. وقد أظهرت التكنولوجيا بالفعل حساسية عاليه (مع نسب E:T منخفضه مثل 1:20) ومجموعه ديناميكية كبيره (مع نسب E:T من 20:1 إلى 1:20) ، والتي لا يمكن تحقيقها بسهوله مع غيرها من المقايسات. وعموما ، فان تنفيذ هذه التكنولوجيا ينبغي ان يسمح بتحليل أكثر دقه للبيانات علي نطاق الانتاجيه العالية التي من شانها ان تعزز تطوير الكواشف الخلية تي السيارات ، والنهوض بالميدان بوتيرة اعلي بكثير.

وفي السنوات الاخيره ، كانت المعالجة بالخلايا التائية للسيارة من أبرز الاختراقات في العلاج المناعي للسرطان لانتكس والأورام الخبيثة التي تكون الدم. مع الولايات الامريكيه الاخيره أداره الغذاء والدواء (FDA) الموافقة علي خلايا السيارات CD19 الموجهة لابيضاض الدم اللمفاوي الحاد ، 4,5. في كانون الثاني/يناير من 2019 ، تم تسجيل أكثر من 700 التجارب السريرية في قاعده بيانات التجارب السريرية (clinicaltrials.gov) ؛ حوالي 450 من هذه المحاكمات كانت اما علي وشك ان تبدا أو كانت بنشاط تجنيد المرضي. تتركز معظم التجارب السريرية علي الأورام الخبيثة الدموية ، والتجارب السريرية التي تستخدم خلايا السيارات التي تستهدف CD20 ، CD22 ، و bcmas ، بالاضافه إلى CD19 ، وهي مستمرة كذلك6،7. في حين ان معظم المحاكمات تستخدم اوتوذاتيه العلاج بالخلايا التائية ، وعدد كبير منهم أيضا استكشاف فائده الخلايا التائية السيارات t8،9،10. علي الرغم من النتائج الواعدة مع الأورام الخبيثة الدموية ، 15. هناك حاجه ماسه لتطوير خلايا السيارات الصلبة الخاصة بالأورام التي يمكن التغلب علي هذه الحواجز لفعالية ومشكله "علي الهدف--قباله الورم" سميه. في حين ان العديد من النهج في المختبر وفي الجسم الحيوي له ما يبرره في تصميم واختبار خلايا السيارات T ، فان الفحص القوي والتنبئي للقوه في المختبر هو من الاهميه الاساسيه16،17.
من أجل تقييم فاعليه خلايا السيارات T ، تم تطوير طرق مختلفه في المختبر. بشكل عام ، يمكن تقسيم هذه المقايسات قوه إلى فئتين واسعه اعتمادا علي ما إذا كانت (ط) قياس مباشره النشاط لحل من خلايا السيارات t ضد الخلايا السرطانية المستهدفة ، أو (2) قياس علامات بديله مثل السايتوكينات التي يتم إصدارها من قبل خلايا السيارات t كما انها تقتل الخلايا الهدف. وتشمل التقنيات التي تقيس النشاط لحل مباشره الكروم-51 فحص الإفراج (CRA)18, الاختبارات المستندة إلى التجارب التي تقيس المبرمج من الخلايا المستهدفة باستخدام مسبارات الفلورسنت19,20, والاختبارات تدفق الخلوي التي تكشف الخلايا المستهدفة ابوتوتيك21. في هذه المقايسات ، وعاده ما تكون الخلايا T المشتركة المستزرعة مع الخلايا المستهدفة التي تم تسميتها مسبقا مع تحقيقات المشعة أو الفلورسنت ، تليها القياس المناسب. علي الرغم من انه منذ فتره طويلة تعتبر معيار الذهب في الميدان نظرا لحساسيتها ، واللجنة السويسرية لديها بعض العيوب. أولا ، هو فحص نقطه النهاية ولا يوفر معلومات حركيه. ثانيا ، يجب تسميه الخلايا المستهدفة بالكروم-51 الذي يميل إلى الارتشاح من الخلايا ويمكن ان يزيد بشكل كبير من الضوضاء الخلفية22. وأخيرا ، فانه يتطلب الاحتياطات المناسبة والتخلص من النفايات المشعة. الاختبارات البديلة ، والتي تقيس المنتجات الثانوية للتفاعل الخلوي مع الخلايا المستهدفة باعتبارها مؤشرا علي الفاعلية ، تتضمن كميات مختلفه من السايتوكينات الصادرة عن خلايا السيارات T باستخدام الطرق المستندة إلى التدفق الخلوي أو الاختبارات المناعية المرتبطة بالانزيم. مره أخرى ، وهذه هي اختبارات نقطه النهاية التي تقيس الإصدار التراكمي من السايتوكينات في نقطه زمنيه معينه ، التالي ، قد لا تعكس بالضرورة النشاط لحل الفعلي للخلايا السيارات T.
عند تطوير مقايسة القوه ، وخاصه التي تحدد معايير الإطلاق للعلاج القائم علي الخلايا مثل خليه T السيارة ، من المهم ان الفحص ينطوي علي الحد الأدنى من التلاعب والتدريب العملي علي الوقت لان كل التفاعل هو متغير آخر يحتاج إلى ان تحسب ويمكن ان تقلل من المتانة الشاملة والاتساق من الفحص. وعلاوة علي ذلك ، فان تفاعل خلايا السيارات T مع الخلايا السرطانية هو عمليه ديناميكية ، وتوفير المعلومات حول هذه التفاعلات الديناميكية ، مثل معدل التحلل الخلوي ، هو من الاهميه الاساسيه لتقييم الفعالية. مع وضع هذه المعايير في الاعتبار ، قمنا بتطوير فحص الفعالية الحركية الخالي من التسمية لخلايا السيارات T التي تستخدم نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي xCELLigence (RTCA). يستخدم xCELLigence لوحات ميكروتيتير المتخصصة (اللوحات الكترونيه) التي تحتوي علي الذهب الحيوية المضمنة في الجزء السفلي من كل بئر. سير العمل بسيط وينطوي ببساطه علي بذر الخلايا المستهدفة في الآبار من اللوحات الكترونيه ، تليها أضافه خلايا السيارات T في نسب مختلفه من المستجيب إلى الهدف (الشكل 1). وبعد ذلك ، وبما ان أجهزه الاستشعار البيولوجي تراقب باستمرار صلاحيه الخلايا المستهدفة ، فان البيانات يتم عرضها تلقائيا في الوقت الحقيقي.
343332 وفي الاونه الاخيره ، تم تقييم المقايسة الرجولية لتصنيع الخلايا التائية (TCR) التي تمت هندستهابال35. هنا نحن تقرير توظيف نظام RTCA لتقييم قوه في المختبر من خلايا السيارات T مصممه لاستهداف الأورام الصلبة والأورام السائلة في العلاجات السريرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

وقد حققت مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) العلاج بالخلايا التائية للسرطان فائده سريريه كبيره للامراض الخبيثة الدموية المقاومة والحرارية مثل ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد في مرحله الطفولة. ويجري حاليا بذل جهود لتوسيع نطاق هذا العلاج الواعد ليشمل الأورام الصلبة بالاضافه إلى السرطانات الدموية الأخرى. هنا ، ونحن وصف تطوير وإنتاج خلايا السيارات T قويه تستهدف مستضدات مع التعبير فريدة أو تفضيليه علي الخلايا السرطانية الصلبة والسائلة. ثم يتم تقييم قوه في المختبر من هذه الخلايا T السيارات في الوقت الحقيقي باستخدام الفحص المستندة إلى مقاومه عاليه الحساسية القائمة علي المعاوقه. علي وجه التحديد ، يتم فحص تاثير مختلف المجالات الإشارات كوستيمولاتوري ، مثل جلوكوكورتيكويد الناجمة عن عامل نخر الورم مستقبلات (tnfr)-البروتين ذات الصلة (gitr) ، علي قوه في المختبر من الخلايا T السيارات. يتضمن هذا التقرير بروتوكولات لما يلي: توليد خلايا السيارات T للدراسات الاكلينيكيه باستخدام لينتيفيرال الجينات ، وتوسيع خلايا السيارات T ، والتحقق من صحة التعبير عن السيارات ، وتشغيل وتحليل اختبارات قوه Xcelligention.

لينتيفيروس اعداد السيارات وتوليد الخلايا التائية وتقييم الفعالية تم تحديد فكسانال من الاستعدادات لينتيفيروس CAR باستخدام مجموعه الكمية RT-PCR (انظر جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وقد استخرج بروتوكول المعايرة بالقياس الحجمي الفيروس RNA أولا ثم قيس رقم نسخه لينتيفيرال RNA الذي أشار إلى كميه الجزيئات الفيروسية المعدية. و عيار من الفيروسات المتولدة من 1 150 mm طبق باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه عاده يتراوح بين 109-10 10 الفيروسية نسخ/مل. يظهر الشكل 2ا رقم دوره RT-pcr مقابل قوه الاشاره من نتيجة pcr الكمية التمثيلية. وبمجرد ان اقتنعت نوعيه الفيروس ، عندما كان عيار أكبر من 1 × 108 pfu/مل ، تم تجميده لأسفل لمحول الخلايا T اللاحقة. بعد تم محوله الخلايا T السيارات مع لينتيفيروس ، تم استزراع الخلايا T لأيام اضافيه 12-14 ، والحفاظ علي كثافتها حول 1 × 106 إلى 2 × 106 خلايا/مل. ثم تم فحص الخلايا T السيارات مع المضادة-ScFv-الجسم محدده باستخدام تدفق الخلوي قبل تطبيق المصب أو تجميد. ويبين الشكل 2باءنتيجة الدفعات التمثيلية الجيدة. باستخدام الأجسام المضادة ScFv ، حوالي 50 ٪ من الخلايا T الملونة الايجابيه (Q2 50.6 ٪ مقابل الخلايا T 1 ٪) ، مما يدل علي التعبير عن سيارة في حوالي 50 ٪ من الخلايا T. وفي وقت لاحق ، تم اجراء فحص قوه RTCA لتحديد سيتولسيس قبل كل دفعه من الخلايا السيارات T جمدت وجاهزه للتطبيق في المستقبل. استغرق دوره واحده من السيارات T-خليه تصميم وتوليد ، واجراء التقييم حوالي 1 شهر.
قتل من [راجي] ورم لمفي [ب] خلايا ب [CD22-كر] [ت] خلايا واستخدمت مجموعه الربط الورم السائل المضادة لCD40 (انظر جدول المواد) في تركيز 4 ميكروغرام/مل لمعطف E-لوحه ل 3 ح في 37 درجه مئوية. بعد غسل الآبار مع العازلة الربط ، تمت أضافه خلايا الغدد الليمفاوية ب الخلية إلى اللوحة الكترونيه في كثافة الخلايا 30,000/جيدا. بعد السماح للخلايا لتسويه لمده 30 دقيقه تم وضع اللوحة الكترونيه مره أخرى داخل الصك اكسسيليليجانس ، وبدات قراءات مقاومه علي الفور من أجل التقاط الخلية المرفقات والانتشار. في اليوم التالي ، تم أضافه اما خلايا t CD22 ، وهميه سيارة T الخلايا ، أو الخلايا T غير محوله. في الشكل 3، تم استخدام نسبه E:T 10:1 لجميع أنواع الخلايا. CD22-الخلايا الراجية الايجابيه ، وتعامل مع خلايا T CD22 العرض قتل كبير (الأثر الأخضر) بالمقارنة مع الضوابط السلبية (الخلايا T غير محوله والخلايا الوهمية T السيارات).
القتل الفعال لخلايا سرطان البنكرياس بواسطة خلايا T CD47 CD47 هو بروتين سكري الغشاء السطحي من العائلة الفائقة الغلوبولين المناعي. 3736 CD47 ومن المعروف أيضا باسم لا ياكل-لي اشاره إلى الضامة ، والتي جعلت منه هدفا العلاجية المحتملة في بعض أنواع السرطان. CD47-تم إنتاج خلايا السيارات T واختبارها ضد خلايا سرطان BxPC3 بنكرياس التي تعبر عن مستويات عاليه من CD4738،39. وقد تم بذر خلايا BxPC3 في اللوحة الكترونيه في اليوم الأول بكثافة 10,000 خليه/بئر. وأظهرت المراقبة في الوقت الحقيقي ان هذه الخلايا وصلت كونفلوينسي بعد 16 ساعة. في هذه النقطة الزمنيه ، تم أضافه الخلايا T السيارات في نسبه E:T 10:1 (الشكل 4ا). وأضيفت أيضا خلايا التحكم المستجيب مثل خلايا T غير محوله والخلايا الوهمية للسيارة T. تظهر النتائج بوضوح ان خلايا CD47 T تقتل بشكل انتقائي الخلايا BxPC3 الهدف29. أيضا ، يظهر الشكل 4ب ان اشاره معاوقه عندما يتم أضافه خلايا CD47 T إلى بئر فارغه اقل بكثير من اشاره معاوقه المتولدة عن الخلايا المستهدفة BxPC3. الخلية فهرسه قيمه من ابار مع [CD47-كر] [ت] خلايا فقط بلغ حد اقصي من 0.14, اي يكون فقط [هيغر] قليلا من الاشاره من متوسطه فحسب (0.02). وهذا يشير إلى انه في هذا الفحص غير المتجانس للقتل ، يتم اشتقاق اشاره المقاومة بشكل حصري تقريبا من الخلايا السرطانية المستهدفة.
التزاوج من الخلايا السيارات T من قبل المجال GITR عندما أعرب في سيارة egfr-gitr-CD3 ، وذكرت في السابق مجال كوستيمولاتوري لتعزيز قتل الخلايا السرطانية egfr الايجابيه SKOV3 ولكن ليس egfr-السلبية mcf-7 الخلايا السرطانية30. لتوضيح دور المجال GITR بشكل أفضل ، تم إنشاء بنيه CAR التي تحتوي علي نطاق كامل الطول GITR ، أو الإصدارات المحذوفة أو المعاد ترتيبها من المجال ، واختبارها من أجل القدرة علي تنشيط خلايا السيارات T (الشكل 5ا). بيانات xcelligence في الشكل 5B, C ويبين ان المجال كوستيمولاتوري يعزز السيارة T قتل الخلية من الخلايا المستهدفة egfr ايجابيه فوق ما لوحظ مع بناء سيارة الأصلي الذي يفتقر إلى مجال gitr. وعلاوة علي ذلك, حذف 10 الأحماض الامينيه من المجال GITR (الأحماض الامينيه 184-193) إلغاء هذا النشاط تنشيطية. وعلي النقيض من ذلك ، ثبت ان أعاده ترتيب الموضع النسبي للمجال GITR داخل بناء السيارات اقل ضررا لقدراتها التنشيطية. وباستخدام بيانات نقطه النهاية ، اظهر إنتاج IFNγ كبديل لتنشيط الخلايا التائية أيضا النشاط المحفز للمجال GITR (الشكل 5ب). وعلي النقيض من بيانات نقطه النهاية التي هي مجرد "طلقه مفاجئه" ، فان صوره المقاومة المستمرة لأداه Xcelligenis تضيء بوضوح الاختلافات الدقيقة في حركيه القتل للعلاجات المختلفة (الشكل 5ج). النتائج التي تم الحصول عليها هنا تتسق مع تلك التي في دراسة الجسم الخارجي30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> الشكل 1: يكشف نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) عن قتل الخلايا المستهدفة من قبل الخلايا المستجيبة. هناك ثلاث خطوات مفاهيمي الرئيسية لقياس نشاط قتل الخلايا المستجيبة للسيارة T ضد الخلايا السرطانية المستهدفة. الخطوة 1: بذر الخلايا المستهدفة (اي الخلايا السرطانية) في بئر اللوحة الكترونيه. تلتصق الخلايا بالأقطاب المجهرية الذهبية وهذا يعوق تدفق التيار الكهربائي بين الأقطاب. يتم قياس هذه القيمة المقاومة ورسمها كمعلمه الرابط تسمي "فهرس الخلية". تزداد قيمه "فهرس الخلايا" كلما زادت الخلايا ووصلت إلى الهضبة مع اقتراب الخلايا من التقارب. الخطوة 2: الخلايا المستجيبة-الخلايا المناعية غير الملتصقة-تضاف فيما بعد. ولان هذه الخلايا لا تلتصق بالأقطاب المجهرية الذهبية ، فانها لا تتسبب بشكل مباشر في تغيير المقاومة. الخطوة 3: إذا كانت الخلايا المستجيبة تهاجم الخلايا السرطانية المستهدفة ، فان تدمير الخلايا السرطانية ينعكس في انخفاض مؤشر الخلية مع مرور الوقت. هذا النشاط لحل من الخلايا المستجيب ، أو قوه الخلايا المستجيب ، يمكن ان تكون حساسة ورصد دقيق. يتيح الحصول المستمر علي بيانات المقاومة من نظام xCELLigence التحليل الحركي في الوقت الحقيقي لحالات متعددة في وقت واحد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> الشكل 2: تحديد Titer لتقييم اللينتيفيروس والتدفق الخلوي لخلايا السيارات T. (ا) قرار لينتيفيرال عيار. خطوط ألوان المختلفة هي عينات تمثيليه لرقم الدورة مقابل دلتا Rn. أرقام دوره منخفضه تشير إلى كميه عاليه نسبيا من الفيروس الحمض الريبي النيبالي القالب الموجود في العينات. (ب) بعد التوصيل ، تم استزراع خلايا السيارة T وصيانتها بكثافة اقل من 2 × 106 خلايا/مليلتر ثم خضعت لتحليل التدفق. يعكس المحور صتلطيخ للخلايا T ، مع القيم الايجابيه تنعكس في المناطق Q1 و Q2. كلا العينتين هي 100 ٪ ايجابيه للخلايا T. يتم تحديد التعبير عن scFV CAR باستخدام Ab الخاص scFv (x-المحور). وتبين النتيجة ان أكثر من 50 ٪ من الخلايا T هي scFv ايجابيه في الخلايا CD22-السيارات T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> الشكل 3: قتل ديناميات خلايا CD22-السيارات ضد خلايا الغدد الليمفاوية راجي بوركيت. وفي حين ان المنحني الأحمر هو خلايا الراجي وحدها ، فان المنحني الأخضر هو خلايا الراجي التي تعامل مع خلايا CD22-CAR T. المنحنيات الوردي والأزرق هي وهميه سيارة T-العلاج الخلية وغير محوله T-خليه العلاج ، علي التوالي. نسبه E:T هي 10:1. أشرطه الخطا هي الانحراف المعياري. يتم اعداد مقياس الوقت في فواصل زمنيه 2 h للعرض السهل علي الرغم من توفر المزيد من نقاط البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> الشكل 4: فعاليه خلايا T CD47 ضد خلايا البنكرياس الصلبة السرطانية. (ا) الوردي هو الخلايا المستهدفة BxPC3 وحدها ، في حين ان الأحمر هو BXPC3 مع CD47-سيارة T الخلايا المضافة. الأخضر هو BxPC3 مع أضافه خلايا T غير محوله ، والأزرق هو مع الخلايا الوهمية السيارات T. نسبه E:T هي 10:1. (B) في نفس الاعداد ، الأحمر هو فارغ (تفتقر إلى الخلايا المستهدفة) الآبار السيطرة مع CD47-السيارات T الخلايا فقط والأخضر هو المتوسطة فقط. أشرطه الخطا هي الانحراف المعياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> الشكل 5: المجال GITR يزيد من النشاط السامة للخلايا الخلية T الخلايا ضد خطوط الخلايا السرطانية الايجابيه EGFR. (ا) مختلف ثوابت السيارات. (ب) القطع الشريطية من النسبة المئوية لليبنيات المختلفة للسيارة في 4 ساعات (يسار) و 24 ساعة (وسط). ويظهر الإنتاج IFNγ في 24 ح علي اليمين. (ج) التقييم المستمر للقتل بالنسبة لجميع الإنشاءات. المنحني الأسود هو منحني نمو خلايا سرطان المبيض BxPC3 فقط. المنحني الأخضر هو الخلايا المستهدفة التعامل مع خلايا T فقط ، المنحني الأزرق هو الخلايا المستهدفة التعامل مع الخلايا الوهمية T السيارات ، والمنحني الأحمر هو الخلايا المستهدفة التعامل مع EGFR-GITR-CD3-الخلايا T ، والمنحني الوردي هو الخلايا المستهدفة التعامل مع egfr-ΔGITR-CD3-سيارة t الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

ونحن وصف الكمية في الوقت الحقيقي في المختبر نظام فحص التحلل الخلوي لتقييم فاعليه الخلايا التائية مستقبلات مستضد تشياريك استهداف الخلايا السرطانية السائلة والصلبة. يمكن توسيع هذا البروتوكول لتقييم الخلايا الأخرى لجهاز المناعة ، فضلا عن العلاجات المركبة.

فحص فاعليه في الوقت الحقيقي للخلايا التائية لمستقبلات مستضد تشياريك التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي تمكنك من رصد كميا قتل الخلايا السرطانية من قبل الخلايا المناعية في ظل ظروف خالية من التسمية وعلى مدى عدة أيام. يوفر هذا النظام دورة زمنية كاملة لقتل الخلايا السرطانية المستهدفة مما يسمح بالفحص المتزامن لعدد كبير من الانشاءات، وأنواع الخلايا المُفعِّلة، أو العلاجات المركبة عند انخفاض التأثير إلى النسب المستهدفة. تبدأ بذر 1.5 مرات 10 إلى الخلايا HEK293FT السبع في المتوسط ثقافة DMEM في طبق ثقافة خلية 150 ملليلتر لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة.في صباح اليوم التالي، مزيج 2.5 ملليلتر من محلول التخفيف transfection تكملها خمسة ميكروغرام من الحمض النووي ناقلات العدسي و 22.5 ميكروغرام من مزيج التعبئة والتغليف العدسي مع 82.5 ميكرولترات من reafection في 2.5 ملليلتر من محلول التخفيف transfection. بعد حضانة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونقل رد فعل إسقاط الحكمة في طبق من خلايا HEK293FT والعودة إلى الخلايا الحاضنة للحضانة الثانية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استبدال المافق مع 19 ملليلتر من ثقافة DMEM الطازجة المتوسطة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة بين عشية وضحاها.جمع المغرور في أنبوب مخروطي واحد 50 ملليلتر لمدة أربع درجات مئوية التخزين لمدة يومين المقبلين قبل الترسب في فيروس العدس عن طريق الطرد المركزي في صباح اليوم الثاني من أجل إزالة أي خلايا أو حطام من المحلول. نقل جميع ما عدا حوالي ملليلتر واحد من فيروس العدس الذي يحتوي على عظمى إلى أنبوب طرد مركزي واضح للغاية للطرد الشديد. بعد الطرد الشديد، وpirate بعناية الفيروس المتبقية التي تحتوي على فائقة، إضافة بلطف 100 ميكرولترات من DMEM إلى بيليه، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة.في نهاية الحضانة، اخلطي الحل بلطف و aliquot حل فيروس العدس في أنابيب معقمات مُبردة للتخزين عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. ثم تحديد تتر من فيروس العدس من قبل كمية RT-PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتوليد الخلايا CAR-T والتوسع، وتفعيل واحد إلى اثنين من مرات 10 إلى الخلايا أحادية النوى الدموية الطرفية الست في ملليلتر واحد من خلية CAR-T المتوسطة مع عدد متساو من الميكروبات المغلفة CD3/CD28 في بئر واحد من لوحة 24-جيدا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.في الصباحين التاليين ، اخلطي ميكرولتر واحد من عامل محسن النقل مع الخلايا متبوعة بإضافة فيروس العدس في تعدد العدوى من خمسة إلى واحد. مراقبة نمو الخلايا T كل يومين إلى ثلاثة أيام إضافة جديدة CAR-T خلية المتوسطة حسب الضرورة للحفاظ على الخلايا في واحد إلى اثنين مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر التركيز. للكشف عن التعبير T خلية CAR عن طريق تدفق cytometry، نقل ثلاث مرات 10 إلى جمهورية أفريقيا الوسطى الخامسة والخلايا التائية غير مستحثة في أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية.جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي و resuspend الكريات في 200 ميكرولترات من العازلة FACS تكملها مصل 1٪ الإنسان. تقسيم كل عينة خلية إلى 100 aliliter في الفردية خمسة ملليلتر أنابيب FACS البوليلتر على الجليد. بعد خمس دقائق، أضف ميكرولتر واحد من شظايا FAB2 الحيوية من الماعز المضادة للماوس FAB2 إلى أنبوب واحد من كل نوع خلية واثنين من ميكرولترات من الأجسام المضادة للعلامة المضادة لعلامات PE التي تحمل علامة إلى الأنبوب الآخر من كل نوع خلية مع خلط شامل.بعد 30 دقيقة على الجليد، وغسل الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من عازلة FACS الطازجة وبعد الطرد المركزي من المابتات. Resuspend الكريات في كبرى المتبقية وإضافة اثنين من ميكرولترات من APC المضادة لـ CD3 واثنين من microliters من 7-AAD إلى كل أنبوب. إضافة ميكرولتر واحد من PE المسمى Streptavidin مع خلط وجيزة إلى أنبوب ملطخة بالأجسام المضادة لـ FAB2 واحتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة.في نهاية الحضانة، تحليل الخلايا حسب تدفق قياس الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية جائن الخلايا التائية عن طريق التشتت إلى الأمام مقابل الجانب التشتت وD3 مقابل التعبير 7-AAD. للحصول على تحليل قوة تحلل الخلايا في الوقت الحقيقي، أضف 50 إلى 100 ميكرولترات من ثقافة الخلية المستهدفة المتوسطة لكل بئر من لوحة إلكترونية وقياس مقاومة الخلفية في أداة محلل الخلية. الكشف عن الخلايا السرطانية المستهدفة من لوحة الثقافة باستخدام التربسين.غسل الخلايا في 15 ملليلتر من ثقافة جديدة المتوسطة والطرد المركزي. resuspend بيليه خلية السرطان في خمسة ملليلترات من المتوسطة الطازجة لحساب وضبط كثافة الخلية لتركيز الخلايا المستهدفة المناسبة. إضافة الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار وترك لوحة الإلكترونية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا لتسوية بالتساوي على الجزء السفلي من الآبار.في نهاية فترة التوازن، ضع اللوحة في محلل الخلية في الوقت الحقيقي وقم ببدء قياس المعاوقة تلقائيًا كل 15 دقيقة بين عشية وضحاها. ويمكن تتبع الالتصاق وانتشار الخلايا المستهدفة في الوقت الحقيقي. في صباح اليوم التالي، تمييع تأثير CAR والسيطرة على الخلايا التائية إلى التركيز المناسب في أنابيب الفردية وإزالة 50 إلى 100 ميكرولترات من كل بئر من لوحة الإلكترونية بحيث يكون حجم النهائي في كل بئر 100 ميكرولترات.بعد ذلك ، بذور المفعول والسيطرة على الخلايا التائية في الآبار المناسبة في effector المناسبة إلى النسب المستهدفة في 100 ميكرولترات من المتوسط في البئر. ثم اكويرات لوحة الإلكترونية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل العودة إلى لوحة نظام محلل الخلية. لقياس فعالية الخلية T بوساطة قتل الخلايا السرطانية المستهدفة، ورصد قتل بواسطة CAR-T لمدة 96 ساعة.حوالي 50٪ من خلايا CAR-T ملطخة إيجابية لمضادة مضادة لسلسلة واحدة متغير تشير إلى التعبير عن CAR في حوالي 50٪ من الخلايا التائية. وفي هذه التجربة التمثيلية، استخدمت نسبة من 10 إلى نسبة واحدة من المُنَمِّر إلى الهدف بالنسبة لجميع المجموعات. خلايا راجي فقط وCD22-CAR الخلية T تعامل خلايا راجي عرض قتل كبير بالمقارنة مع خلية التحكم T فقط ومجموعات خلية CAR-T موك.في هذه التجربة، كانت خلايا CD47-CAR-T فقط فعالة في قتل خلايا سرطان البنكرياس. علاوة على ذلك، كانت إشارة المعاوقة من خلايا CD47-CAR-T وحدها أعلى قليلاً من إشارة مؤشر الخلية التي تقاس في الآبار المتوسطة وحدها مما يشير إلى أن إشارة المعاوقة الناتجة عن خلايا التعليق مثل خلايا CAR-T هي الحد الأدنى ولا تساهم في إشارة المعاوقة الإجمالية عندما تضاف خلايا CAR-T إلى الخلايا السرطانية المستهدفة. وتجدر الإشارة إلى أن المجال المشترك لحفز النتائج في مجال جي تي لوحظ أنه أكثر فعالية في تعزيز قتل خلايا CAR-T ضد الخلايا الإيجابية لمستقبلات عامل النمو الظهاري مقارنة ببنيات CAR الأصلية بدون نطاق GITR.يمكن جمع الوسيطة من آبار الألواح الإلكترونية لتحليل ملف السيتوكين في الوقت المناسب سواء أثناء أو بعد الفحص وفقًا لاحتياجات التجربة. عموما، وقد تحسنت xCELLigence كفاءة تقييم قوة العلاج المناعي المتنوعة بدءا من ثنائية محددة الخلية T المشاركة والفيروسات oncolytic لمثبطات نقطة الاختيار المناعية في العلاجات المركبة.

فحص فاعليه في الوقت الحقيقي للخلايا التائية لمستقبلات مستضد تشياريك التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية

Abstract