עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי מעניק POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X., מכוני הבריאות הלאומיים להעניק K01HL130497 משום מקום

אוניברסיטת ואנדרבילט אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש אישרו ההליכים המתוארים במסמך זה. עכברים הם שוכנו, דאגו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (Press Academies הלאומית. 2010 המתוקן).
1. בידוד של טחולים של עכברים
<ol><li>הכן 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 מ"מ HEPES, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מיקרומטר β-mercap...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort.">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li><li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure.">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).</li><li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance.">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li><li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension.">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li><li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity,+pulse+pressure,+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans.">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li><li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension.">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li><li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension.">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li><li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism.">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li><li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients.">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li><li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity,+inflammation,+and+hypertension.">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li><li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension.">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li><li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertensive+end-organ+damage.">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li><li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension.">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li><li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li><li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertension.">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

בפרוטוקול הנוכחי, לנו יש אופטימיזציה הליכים כדי לבודד CD11c+ DCs מ טחולים של עכברים, adoptively להעביר אותם לתוך תמים חיות ללמוד את התפקיד של בקרי קבוצת מחשבים במלח-induced יתר לחץ דם. פרוטוקול זה ניתן להתאים לבודד ולהעביר adoptively קבוצות משנה אחרים תא החיסון כולל מקרופאגים, ומונוציטים מסתגלת תאים ח...

עודף מלח תזונה הוא גורם סיכון עיקרי עבור יתר לחץ דם. 1 , 2 American Heart Association ממליץ 2,300 מיליגרם (מ ג) של צריכת נתרן (Na+) ליום, לכל היותר פחות מ-10% מאוכלוסיית ארה ב מתבונן המלצה זו. 3 , 4 צנוע הפחתות צריכת Na+ להוריד את לחץ הדם, לצמצם את המקרים החדשים השנתי של מחלת לב כלילית, קו בארה ב 20%. 5 בעיה רצינית עם עודף צריכת מלח הוא כי 50% מהאוכלוסיה עם יתר לחץ דם תערוכות מלח-רגישות, כהגדרתו העלאה של 10 מ מ כספית בלחץ הדם בעקבות Na+ טעינה או ירידה דומה בלחץ הדם לאחר Na+ ההגבלה ו diuresis. 6 מלח-רגישות גם מתרחשת ב- 25% של אנשים normotensive, חזאי עצמאית של מוות ושל אירועי לב וכלי דם. 7 , 8 מנגנוני חישה מלח יתר לחץ דם המערבים את הכליה. ובכן נחקרו; אולם, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תאי המערכת החיסונית יכולה לחוש Na+. 9 , 10
ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים במיוחד כליות נה+ טיפול יכול לגרום להצטברות של Na+ interstitium ולקדם דלקת. 11 , 12 מעבדה שלנו ואחרים הראו כי תאים של שני מולדת, מסתגלת המערכת החיסונית לתרום החרפה של יתר לחץ דם. 9 , 13 , 14 , 15 שונים לחץ דם גבוהה לגירויים, כולל אנגיוטנסין II, נוראדרנלין, כי מלח מקרופאגים, ומונוציטים ו- T לימפוציטים לחדור את הכליות ואת להערכת ולקידום השמירה Na+ , vasoconstriction, לחץ דם העלאת ונזק סוף-איברים. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 במחקרים קודמים, מצאנו כי DCs להצטבר isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts בתגובה לגירויים שונים עם יתר לחץ דם, לרבות אנגיוטנסין II ו- DOCA-מלח יתר לחץ דם. 14 IsoLGs מוצרים מאוד תגובתי של השומנים peroxidation במהירות, covalently adduct כדי lysines על חלבונים, הצטברות שלהם קשורה DC הפעלה. 14 הקמנו לאחרונה כי מוגברות Na+ הוא גירוי חזק עבור IsoLG-חלבון adduct-צורה מאתר Dc-9 Na+ כניסתו DCs מתווך באמצעות מובילי רגיש amiloride. נה+ ואז חילופי לקבלת סידן (Ca2 +) דרך בכל הארץ, ד2 + מחליף נה+. Ca2 + מפעיל קינאז C (PKC) אשר מפעיל את אוקסידאז nadph ל המוביל סופראוקסיד מוגברת (O2· -), IsoLG-חלבון adduct גיבוש. 9 ההעברה המאמצת של מלח החשופים DCs הפריימים יתר לחץ דם בתגובה מנה תת pressor של אנגיוטנסין II. 9
זיהוי של CD11c+ DCs רקמות הוגבלה בעבר אימונוהיסטוכימיה, RT-PCR, בידוד של בקרי קבוצת מחשבים הוגבלה לתא מיון לפי cytometry זרימה. למרות cytometry זרימה מיון תא היא שיטה חזקה הבידוד של תאים חיסוניים, שזה יקר, זמן רב, מה שמוביל תשואה נמוכה של התאים קיימא. לכן, אנו יש אופטימיזציה פרוטוקול צעד אחר צעד עיכול רקמת, גירוי במבחנה של העברה המאמצת של CD11c+ DCs ללמוד ביתר לחץ דם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

עודף צריכת המלח תזונתיים תורמת דלקת ואת ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות של יתר לחץ דם. קודם לכן מצאנו כי אנטיגן תאים דנדריטים (Dc) יכול לחוש נתרן גבוהות חוץ-תאית, המוביל את ההפעלה של אוקסידאז nadph ל היווצרות של isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts. אלה IsoLG-חלבון adducts מגיבים עם עצמי-חלבונים ולקדם אוטואימונית כמו המדינה ויתר לחץ דם. יש שפותחה ואנו ממוטב המדינה-of-the-art שיטות ללמוד הפונקציה DC ביתר לחץ דם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד, ב- חוץ גופית הטיפול עם נתרן גבוהות, והעברה המאמצת של הטחול מאתר CD11c+ תאים לתוך עכברים הנמען ללמוד את תפקידם של יתר לחץ דם.

איור 1 מייצג תיאור סכמטי של השלבים המתוארים לעיל. טחולים מאתר מבודד מסודרים עבור CD11c+ Dc לתא מגנטי ומיון מצופה מדיה מלח רגיל (NS; 150 mmol NaCl) או מדיה מלח גבוהה (HS; 190 mmol NaCl) עבור ה 48 CD11c+ DCs הם מכן הועבר adoptively על ידי רטרו-מסלולית הזרקה לעכברים הנמען תמים. עש?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.

בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומים של יתר לחץ דם ומחלות לב וכלי דם כולל המחקר של תאים דנדריטיים חיוביים CD11c וכיצד הם potentiate את התפקיד של פגיעה יתר לחץ דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הבידוד של תאים דנדריטיים חיוביים CD11c מאיברים מוצקים ואת המחקר של תפקידם הפיזיולוגי במצבי מחלה שונים. אז תהליך זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים חיסוניים מרובים, כולל לימפוציטים B, לימפוציטים T, מונוציטים, מקרופאגים.הדמיה של הטכניקה היא קריטית להבנת בידוד תאים דנדריטיים, במיוחד תהליך ההעברה המאמץ לעכברים נמען. כדי להתחיל, לרסס את החזה ואת הצדדים של העכבר המתת דם עם 70% אתנול. בצד שמאל, בזהירות לפתוח את העור ואת חלל צפי כדי לחשוף את הטחול.באמצעות מדפים קטנים, בזהירות להזיז את המעיים והכבד לצד שמאל של העכבר. לאחר מכן השתמש במספריים קטנים כדי למלמל בעדינות את הטחול. מניחים כל טחול excised לתוך צינור C שכותרתו המכיל שלושה מיליליטר של RPMI 1640 בינוני.ראשית להוסיף קולגנס D ו DNase מוכן RPMI 1640 בינוני להכין את פתרון עיכול הטחול. מניחים את צינור C על homogenizer אוטומטי למחצה ולהבטיח כי הצינור ממוקם בחוזקה על הזרוע המסתובבת. לחץ על לחצן ההפעלה של homogenizer כדי להפעיל את פרוטוקול הטחול 04.01 למשך 60 שניות.לאחר מכן, לנתק את הצינור מן homogenizer ולהדגר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס תחת רציף ב 20 סל"ד במשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להעביר את הפתרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר לאחר סינון זה דרך מסננת 40 מיקרומטר. לשטוף את מסננת עם 10 מיליליטר של dPBS.צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז לשאפת את supernatant לחלוטין לשטוף את גלולה על ידי השעיה מחדש אותו 10 מיליליטר של dPBS. צנטריפוגה ההשעיה ב 300 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.להשעות מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של dPBS. השתמש בהמוציטומטר ובהדרה כחולה של Trypan כדי לספור את מספר התאים. הצנטריפוגה הבאה ב 300 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה את התאים.שאפו את העל-טבעי לחלוטין והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-400 מיליליטר של חיץ מיון תאים המופעל מגנטית. לאחר מכן הוסיפו 100 מיליליטר של חיידקים CD11c לכל 100 מיליון תאים. מערבולת ההשעיה התא דגירה במשך 10 דקות במקרר בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של מאגר MACs לשטוף את התאים צנטריפוגה ב 300 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שאף את העל-טבעי לחלוטין והשהה מחדש את התאים ב- 500 מיליליטר של מאגר MACs. מניחים את עמודת ה- LS בשדה המגנטי של מפריד המג וממקמים צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את הזרימה.לאחר מכן, שטפו את העמודות בשלושה מיליליטר של חיץ. מקם את ההשעיה של התא על כל עמודה ואסוף את הזרימה שדרבה מכיל תאים ללא תווית. לשטוף את העמודים עם שלושה מיליליטר של מאגר MACs ולאסוף את התאים ללא תריס העוברים.לשטוף את עמודות LS פעמיים נוספות באמצעות שלושה מיליליטר של מאגר MACs לכל לשטוף. לאחר מכן, הסר את עמודות LS מהמפריד המגנטי. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר MACs לכל עמודה ומיד לצלול כל עמודה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ברור כדי לשטוף את התאים המסומנים מגנטית.השתמש בהמוציטומטר ובהדרה כחולה של Trypan כדי לקבוע את מספר ה- DC החיובי של CD11c כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן לדלל את דגימת התא בדילול אחד לאחד ב 0.4%פתרון כחול טריפאן. תחילה, הכן את כדורי התא במדיה של תרבות DC כמתואר בפרוטוקול הטקסט.פיפטה 900 מיקרוליטרים של ההשעיה DC לתוך צלחת בז תחתונה שטוחה 24 באר. הוסף 100 microliters של מדיה תרבות DC מלח גבוה לכל באר, עבור ריכוז נתרן סופי של 190 מילימולר. סמן את הצלחת והצב אותה באינקובטור פחמן דו חמצני לח ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.לאחר 48 שעות מוציאים את הצלחת מהחמה. פיפטה מדיה תרבות התא באר אחת למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את תקליטורי ה- DCs החיוביים של CD11c. העבר את כל ההשעיה הזו בצינור 1.6 מיליליטר תואם.חזור על זה עבור כל באר בודדת כי היה מצופה. צנטריפוגה כל הצינורות ב 300 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת DC עם 100 מיקרוליטרים של dPBS סטרילי.לאחר מכן, צייר את פתרון DC מאחד הצינורות למזרק מיליליטר אחד, מצויד במחט 27 מד חצי אינץ '. הנח את הזכר הנאיבי בן 10 שבועות C57-black-6 עכבר תחת 2%isoflurane כדי להשיג מישור כירורגי יציב. בדוק את רמת ההרדמה עם חוסר רפלקס דוושה.לאחר מישור כירורגי יציב מושגת, לאט ובזהירות להציג את המחט לתוך החלל רטרו מסלולית בזווית של כ 30 מעלות. מזריקים לאט ובחלקה את מתלי DC החיוביים CD11c. לאחר השלמת ההזרקה, הסר בזהירות את המחט לחלל רטרו-מסלולית, הקפד לא לפגוע בעין.לאחר מכן להסיר את העכברים מן חרוט האף לפקח עליהם במשך כ 30 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה. ניתוח לחץ דם טיפוסי מוצג כאן בעקבות העברה מאמצת של DCs ומשאבות מיני osmotic שהושתלו עבור עירוי אנגיוטנסין II במינון נמוך. יש לציין כי זה מינון נמוך של אנגיוטנסין II הוא מינון מדכא שאינו מגביר את לחץ הדם בעכבר נורמלי.עכברים המקבלים תקליטורים חיוביים CD11c שטופלו במלח שומרים על לחץ דם תקין במהלך העירוי, בעוד שהעכברים המקבלים תקליטורים חיוביים בעלי מלח גבוה מציגים עלייה בלחץ הדם הסיסטולי. ניתוח ציטומטריית זרימה מבוצע לאחר מכן תוך שימוש באסטרטגיית gating המוצגת כאן כדי לקבוע את הטוהר של התאים החיוביים המבודדים CD11c. העשרה מוגברת של התאים החיוביים CD11c נתפסת בהשוואה הטחול הכולל.ריכוזי CD11c Microbead שונים מנוצלים לפתרון בעיות בפרוטוקול היצרן. הפרד מגנטי של טחול באמצעות 100 microliters של Microbeads מניב כ 65% של תאים חיוביים CD11c, תוך שימוש 200 microliters מניבה 55%ושימוש 300 microliters מניבה 50% חוסם FcR כלול יחד עם 100 מיקרוליטרים של Microbeads. בעקבות ההפרדה המגנטית, המצור של FcR מניב כ 65%CD11c תאים חיוביים.כמה טחול לאחר מכן דגירה עם 100 microliters של Microbeads ומופרדים מגנטית דרך עמוד LS. התאים המופרדים דגירה עם 100 microliters נוספים של CD11c ומופרדים שוב באמצעות עמודת LS. תהליך בידוד כפול זה הניב תאים חיוביים של 92%CD11c.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לאשר את טוהר התאים המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר בידוד מגנטי של תאים דנדריטיים הם יכולים להיות מתורבתים כדי לקבוע את מצב ההפעלה שלהם על ידי טכניקות מולקולריות כולל פרוטומיקה וריווח תא יחיד. מאז התפתחותו, כעת ניתן ללמוד את הפונקציה ואת התפקיד הספציפי של תאים דנדריטיים ביתר לחץ דם.החוקרים חוקרים כעת את האנטיגנים הספציפיים ביתר לחץ דם.

בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

Abstract