Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Un screen genetico per alleli mutanti che sopprimono fenotipici difetti causati da una mutazione è un approccio potente per identificare i geni che appartengono a vie biochimiche strettamente correlate. Metodi precedenti quali la matrice genetica sintetico (SGA) analisi e tecniche di mutagenesi casuale usando raggi ultravioletti (UV) o sostanze chimiche come methanesulfonate etilico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU), sono stati ampiamente usati ma sono spesso costosi e laborioso. Inoltre, questi metodi di screening basato su mutageno sono frequentemente associati a gravi effetti collaterali sull'organismo, inducendo mutazioni multiple che aggiungono alla complessità di isolare i soppressori. Qui, presentiamo un protocollo semplice ed efficace per identificare le mutazioni soppressore in mutanti che conferiscono un difetto di crescita in Schizosaccharomyces pombe. L'idoneità delle cellule ad un deficit di crescita standard multimediali liquido o mezzi liquidi sintetici possa essere monitorato per il recupero utilizzando un lettore di piastra a 96 pozzetti automatizzato per un periodo prolungato. Una volta che una cellula acquisisce una mutazione di soppressore nella cultura, suoi discendenti prevalere quelle di cellule parentali. Le cellule recuperate che hanno un vantaggio di crescita competitiva rispetto a cellule parentali possono essere isolate e backcrossed con cellule parentali. Vengono quindi identificate le mutazioni soppressore tramite sequenziamento intero genoma. Utilizzando questo approccio, abbiamo con successo isolato soppressori più che alleviare i difetti di sviluppo severo causati dalla perdita di Elf1, una famiglia di AAA + ATPasi che è importante nel trasporto di mRNA nucleare e mantenimento della stabilità genomica. Ci sono attualmente oltre 400 geni in S. pombe con mutanti che conferisce ad un difetto di crescita. Come molti di questi geni sono atipici, proponiamo che il nostro metodo si affretterà l'identificazione di nuove interazioni funzionali con questo approccio user-friendly, ad alta velocità.