Inibizione di crescita di Aspergillus flavus e produzione di aflatossina nel mais transgenici che esprimono la α-amilasi inibitore da Dolichos lablab L.

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per analizzare Aspergillus flavus crescita e produzione di aflatossina in chicchi di mais che esprime una proteina di antimicotica.  Usando un ceppo che esprimono GFP a. flavus abbiamo controllato l'infezione e la diffusione del fungo nei kernel maturo in tempo reale. Il test è rapido, affidabile e riproducibile.

Abstract

Contaminazione da aflatossina nelle colture di alimenti e mangimi è una sfida importante in tutto il mondo. Le aflatossine, prodotte dal fungo Aspergillus flavus (a. flavus) sono agenti cancerogeni potenti che sostanzialmente riducono il valore di ritaglio in mais e altre colture ricche di olio come arachidi oltre che propongono una minaccia seria per la salute umana e animale. Diversi approcci, tra cui allevamento tradizionale, espressione transgenica di resistenza associata proteine e RNA interference (RNAi)-base di silenziamento genico indotto da host di critica a. flavus geni bersaglio, vengono valutate per aumentare resistenza di aflatossina nelle colture sensibili. Studi precedenti hanno mostrato un ruolo importante di α-amilasi in produzione patogenesi e aflatossina a. flavus , suggerendo questo gene/enzima è un potenziale bersaglio per ridurre sia la crescita di a. flavus che la produzione di aflatossina. A questo proposito, lo studio corrente è stato intrapreso per valutare l'espressione eterologa (sotto il controllo del promotore 35S CaMV costitutivo) di una proteina del tipo di inibitore della α-amilasi Dolichos lablab L. (AILP) nel mais contro a. flavus. AILP è una proteina di 36-kDa, che è un inibitore competitivo dell'enzima α-amilasi a. flavus e appartiene alla famiglia delle proteine lectine – arcelin – α-amilasi inibitore in comune con fagioli. Studi in vitro prima di iniziare il lavoro corrente avevano dimostrato il ruolo di AILP nella inibizione dell'attività α-amilasi a. flavus e crescita fungina. Crescita fungina e produzione di aflatossina in granella maturo sono stati monitorati in tempo reale utilizzando un ceppo che esprimono GFP a. flavus . Questo kernel lo screening test (KSA) è molto semplice da configurare e fornisce dati affidabili e riproducibili su infezione e il grado di diffusione che poteva essere quantificati per la valutazione di germoplasma e linee transgeniche. La fluorescenza dal ceppo GFP è strettamente correlata alla fungine crescita e, per estensione, è ben correlata ai valori di aflatossina.  L'obiettivo del lavoro attuale era di implementare questa conoscenza precedente in una coltura commercialmente importante come il mais per aumentare la resistenza di aflatossina. I nostri risultati mostrano una riduzione del 35%-72% in crescita di a. flavus nei kernel mais transgenici esprimenti AILP che, a sua volta, si traduce in una riduzione del 62%-88% nei livelli di aflatossina.

Introduzione

Contaminazione da micotossine di generi fungini, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria è un grave problema di cibo e mangimi coltivati in tutto il mondo^1,2,3. Tra questi funghi fitopatogeni, Aspergillus ha il più alto impatto negativo sul valore delle colture e salute umana e animale. Aspergillus flavus (A. flavus) è un agente patogeno opportunistico pianta che infetta ricca oleaginose quali mais, semi di cotone e arachidi e produce i potenti cancerogeni, aflatossine, così come numerosi metaboliti secondari tossici (SMs). Mais è un alimento importante e nutrire le colture di tutto il mondo ed è altamente sensibili alla contaminazione da a. flavus. L'impatto economico della contaminazione da aflatossine su perde e valore ridotto in mais può essere tanto quanto $ 686,6 milioni/anno in US² con i previsti cambiamenti nel clima globale, l'impatto delle aflatossine potrebbe comportare perdite economiche maggiore nel mais con stime su quanto $ 1,68 miliardi/anno nel vicino futuro². Dato gli effetti economici e sanitari delle aflatossine negli esseri umani e bestiame, controllo di pre-raccolta aflatossine nel mais potrebbe essere il modo più efficace per prevenire la contaminazione da aflatossine negli alimenti e mangimi.

L'approccio di controllo principale di pre-raccolta per resistenza di aflatossine nel mais che è stato ampiamente utilizzato in questi ultimi decenni è principalmente attraverso l'allevamento, che richiede una notevole quantità di tempo⁴. Recentemente, biocontrol ha avuto certo successo nella riduzione di aflatossina in larga scala campo applicazioni^5,6. Oltre biocontrollo, applicazione di strumenti molecolari all'avanguardia come 'Host indotto silenziamento genico' (Villa) attraverso la RNAi e transgenici espressione di proteine associate a resistenza ha avuto un certo successo nella riduzione della crescita di a. flavus e aflatossina produzione in studi di laboratorio e sul campo di piccola scala. Questi approcci sono attualmente in fase di ottimizzazione oltre a individuare nuovi potenziali target di gene a. flavus per modifica futura.

Oltre a geni che sono direttamente coinvolti nella produzione di micotossine come potenziali obiettivi delle strategie di controllo transgenici, amilasi fungine hanno dimostrate di giocare un ruolo critico nel mantenimento della produzione di patogenesi e micotossine successo durante le fasi iniziali di infezione di pianta ospite. Alcuni esempi includono Pythium pleroticum (agente eziologico della putrefazione di zenzero rizoma), Fusarium solani (agente causale della verticillosi cavolfiore), dove le correlazioni positive tra espressione di patogenicità e α-amilasi e attività sono state osservate ^7,8. Inibizione dell'attività α-amilasi tramite knockout del gene o approcci atterramento influenza negativamente la produzione della tossina e di crescita fungina. Un mutante di knockout di α-amilasi di a. flavus è stato in grado di produrre aflatossine quando coltivate su amido substrato o degermed chicchi di mais⁹. Allo stesso modo, in Fusarium verticillioides un ceppo di knockout di α-amilasi non è riuscito a produrre fumonisina B₁ (micotossine) durante l'infezione di chicchi di mais¹⁰. In uno studio più recente, Gilbert et al (2018) hanno dimostrato che una basata su RNAi abbattere di espressione di α-amilasi a. flavus attraverso Villa ridotto significativamente a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l'infezione del kernel mais¹¹ .

Inibitori specifici dell'attività α-amilasi hanno anche prodotto risultati simili come ottenuti da giù-regolamento dell'espressione di α-amilasi. Il primo rapporto sul ruolo di un inibitore di α-amilasi fungina resistenza è venuto dall'isolamento e la caratterizzazione di un inibitore della tripsina-α-amilasi 14-kDa da linee di mais resistente a. flavus¹². Ulteriori controlli di diverse centinaia di specie di piante da fattori e Woloshuk ha portato all'identificazione di una proteina di kDa 36 α-amilasi inibitore-come (AILP) dai semi di fagioli di Giacinto, Dolichos lablab L.¹³. La sequenza del peptide di lectine AILP somigliava appartenente alla famiglia delle lectine – arcelin – α-amilasi inibitore segnalato in comune fagiolo^14,15. AILP purificato non presenta alcuna attività inibitoria nei mammiferi tripsina e ulteriore caratterizzazione in vitro ha mostrato l'inibizione significativa di crescita a. flavus e germinazione conidial¹³. Le relazioni presentate qui chiaramente spettacoli α-amilasi possono servire come una destinazione negli approcci di controllo per limitare gli agenti patogeni o parassiti che dipendono dalla mobilitazione di amido (attraverso attività di α-amilasi) e acquisizione di zuccheri solubili come fonte di energia durante il loro patogeno interazione con piante ospiti.

Alfa-amilasi sono conosciuto per essere critici a. flavus patogenicità^9,10,11e data l'importanza dell'AILP come un potente anti-a. flavus agente (α-amilasi inibizione/antigrowth)¹³, Abbiamo generato piante di mais transgeniche esprimenti Lablab AILP gene sotto il promotore CaMV 35S costitutivo. L'obiettivo era di studiare se l'espressione eterologa di questa α-amilasi inibitore nel mais è efficace contro a. flavus patogenesi e aflatossina produzione durante l'infezione del kernel mais. I nostri risultati dimostrano che chicchi di mais transgenici che esprimono AILP significativamente ridotto a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l'infezione del kernel.

Protocollo

1. plasmide costrutti e trasformazione mais

1. PCR amplificano Lablab AILP inserire utilizzando i primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'e 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Le condizioni PCR includono una denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s (passaggio 1), seguita da denaturazione a 98 ° C per 10 s (passaggio 2), ricottura a 55 ° C per 30 s (passaggio 3), l'allungamento a 72 ° C per 20 s (passaggio 4), 31 cicli di passaggio 2 al passaggio 4 , e un allungamento finale passo a 72 ° C per 5 min, Clone del prodotto di PCR in un pCAMBIA modificato 1.300 vector utilizzando Xbaio e Pstsono siti di restrizione. Sequenza il vettore di destinazione finale pianta per confermare l'orientamento e la sequenza del gene di AILP clonato nel vettore.
2. Trasformare Agrobacterium ceppo EHA101 con il costrutto di vettore finale (Figura 1) come in precedenza descritto ¹⁶.
3. Utilizzare trasformati Agrobacterium contenente il vettore di destinazione finale pianta per trasformare gli embrioni immaturi mais (Zea mays L. Hi-II) (eseguiti presso l'impianto trasformazione impianto di Iowa State University) ¹⁶.
4. Crescere T₀ piante in serra (26 – 29 ° C; fotoperiodo 16/8 h completati con Na-lampade ad alta pressione) e ripetutamente subcoscienza per ottenere T₆ generazione per raggiungere l'omozigosi per il tratto transgenico.

2. test di germinazione di spore

1. Raccogliere campioni di foglia e conservare a-80 ° C. Macinare i campioni di foglia con un mortaio e pestello usando azoto liquido. Pesare 0,5 g in provette microcentrifuga da 2 mL, aggiungere 17 µ l di inibitore della proteasi e inserire le provette sul ghiaccio.
2. Centrifugare le provette per 10 min a 16.000 x g. Trasferire 225 µ l di Estratto della pianta per microcentrifuga 0,5 mL e metterli su ghiaccio.
3. In una provetta da centrifuga da 15 mL, preparare una sospensione di spore di 5ml di Aspergillus flavus 70 – GFP in brodo di 1% patata destrosio (w/v). Vortice e regolare la concentrazione di spore a 10⁵ spore/mL con un emocitometro.
   Attenzione: A. flavus produce aflatossine, tutto il lavoro con questo fungo deve essere condotto in una cappa di sicurezza biologica.
4. Incubare in PDB a 28 ° C fino a quando la cultura raggiunge il 50% l'inizio della germinazione delle spore come indicato dal rigonfiamento delle spore.
5. Estratto di vortice e aliquota 25 µ l soluzione di spora alla pianta 225 µ l. Incubare i campioni per 20 ore a 28 ° C con agitazione intermittente.
6. Aliquotare 25 µ l di soluzione di spore su un vetrino da microscopio e misura la lunghezza del germe tubi spore utilizzando il software della fotocamera digitale. Utilizzare un minimo di 20 misurazioni duplicate per ogni riga.
   Nota: In questa fase, inserire tutte le culture a 4 ° C per fermare la crescita di Colonia fino al momento di contare.

3. kernel Screening Test (KSA)

1. Costruire tappi KSA incollando 4 Salvapercussori (22 mm) in una capsula Petri 60 x 15 mm. Consentire la colla si asciughi per 48 H prima di usare tappi. Ogni cap KSA costituisce una Rep (Figura 2).
2. In una sterile cappa di sicurezza biologica, spruzzare un vassoio quadrato analisi biologica (24 x 24 cm) con 70% etanolo: H₂O (v/v) e lasciare asciugare aria. Aggiungere carta cromatografia sterile al vassoio. 9 KSA protezioni dello spruzzo con etanolo al 70%, lasciare aria a secco e posizionare nel vassoio di analisi biologica.
3. Per ogni linea di mais transgenico in fase di test, selezionare 20 noccioli intatti e posto in una provetta da centrifuga 50 mL. Aggiungere etanolo al 70% e lasciate riposare per 4 minuti. Agitare delicatamente i tubi durante la sterilizzazione. Versare il kernel di etanolo e sciacquare tre volte in sterile deionizzata H₂O.
4. Preparare una sospensione di spore di Aspergillus flavus 70 – GFP¹⁷ da una 6 giorno vecchia cultura cresciuta sul mezzo V8 (5% succo V8, agar 2%, pH 5.2).
   1. Aggiungere 20 mL sterile 0,02% Triton X-100/deionizzata H₂O (v/v) e rottami fuori le spore con un'ansa sterile. Dispensare l'inoculo e posto in un becher da mL 300 sterile.
   2. Preparare una diluizione 5 volte con 0,02% Triton X-100, quindi eseguire un conteggio di spora con un emocitometro. Se necessario, per ottenere 100 mL con una concentrazione di 4 x 10⁶ spore/mL, diluire nuovamente.
5. Posto noccioli in un becher da mL 300 sterile con un'ancoretta. Aggiungere inoculo Becher.
   Attenzione: L'aggiunta di gherigli di inoculo causerà soluzione a spruzzo. Porre il becher su un piatto di mescolare per 3 minuti. Dopo 3 minuti, versate dell'inoculo in un bicchiere vuoto.
6. Mezzo di un forcipe, posto kernel nel piatto analisi biologica (1 coperchio). Aggiungere 30 mL di acqua deionizzata al fondo di ogni vassoio di analisi biologica e incubare a 31 ° C al buio per 7 giorni.
7. Preparare noccioli per la fotografia.
   1. Mettere da parte 4 kernel da ogni riga per analisi microscopica e la fotografia.
      Nota: Kernel possono essere memorizzati a 4 ° C per non più di 5 giorni prima di completare la fotografia.
   2. Prendere le immagini del kernel dopo sette giorni di inoculazione con a. flavus (Figura 3).
   3. Pulito esterno del kernel con un tessuto morbido e acqua deionizzata. Eseguire sezioni longitudinali dei noccioli e immediatamente scattare fotografie al microscopio fluorescente.
8. Preparare kernel per l'analisi.
   1. Pulito esterno dei rimanenti kernel con un tessuto morbido e acqua deionizzata.
   2. Posto 4 kernel, che costituiscono 1 rappresentante, in un policarbonato di tappo a vite di 15 mL fiala contenente 2 sfere in acciaio inossidabile. Congelare immediatamente fiale in azoto liquido e conservare a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione e analisi.
   3. Rimuovere le fiale dal congelatore a-80 ° C e macinare chicchi in un omogeneizzatore a 1.500 giri/min per 3 minuti.
      Nota: Tenere i kernel congelato con azoto liquido.

4. proiezione PCR di chicchi di mais transgenici

1. Utilizzare kit di isolamento del DNA per isolare il DNA genomico (gDNA) da chicchi di mais polverizzati infettati da a. flavus secondo le istruzioni del produttore. Brevemente, aggiungere 280 µ l di tampone F, 20 µ l proteasi e 3 µ l ditiotreitolo (DTT) a 10-15 mg di chicchi di mais polverizzati. Incubare e agitare in un thermomixer (56 ° C, 1.200 giri/min, 30 min). Centrifugare a 10.000 x g per 1 min e trasferire il sovranatante chiaro colonna equilibrato. Incubare a temperatura ambiente per 3 min e centrifugare a 700 x g per 1 min eluire gDNA.
2. Prendere 0,8 µ l di Estratto gDNA impostare una reazione di PCR 20 µ l di ciascun campione utilizzando un kit PCR. Seguire le condizioni thermocycling come consigliato nel protocollo del produttore. Le condizioni PCR includono una denaturazione iniziale a 98 ° C per 5 min (passaggio 1) seguita dalla denaturazione a 98 ° C per 5 s (passaggio 2), ricottura a 55 ° C per 5 s (passaggio 3), l'allungamento a 72 ° C per 20 s (passaggio 4), 40 cicli di passaggio 2 al passaggio 4 e un passo di allungamento finale a 72 ° C per 1 min (passo 5).
3. Utilizzare forward primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' e reverse primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' per confermare la presenza di Lablab AILP gene in chicchi di mais transgenici.

5. isolamento del RNA, sintesi del cDNA e RT-PCR semi-quantitativa

1. Prendere omogeneizzato a. flavus infettati chicchi di mais precedentemente conservati a-80 ° C per l'estrazione di RNA. Estrarre RNA usando un kit di isolamento del RNA totale secondo il protocollo del produttore ma con leggera modifica¹⁸. Dopo l'aggiunta di 50 mg di polvere di kernel mais omogeneizzato nel buffer dell'estrazione, mescolare bene (senza Vortex) utilizzando una punta di pipetta da 1 mL e lasciarlo sul ghiaccio per 5-6 minuti prima di procedere ai passaggi successivi come descritto nel protocollo del produttore.
2. Preparare cDNA usando un kit di sintesi di cDNA secondo protocollo ^{18 del produttore}.
3. Utilizzare 0,5 µ l di cDNA non diluito per reazione di PCR per RT-PCR semi-quantitativa come precedentemente descritto¹⁸. Utilizzare il primer forward e reverse qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' e qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' rispettivamente per rilevare Lablab AILP espressione genica e avanti e indietro primer qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ e qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ rispettivamente per l'espressione del mais ribosomiale strutturale gene (Rib), GRMZM2G024838¹⁹ come un gene di mantenimento della casa.

6. quantificazione di GFP

1. Preparare 50 mL ciascuno di 0,2 M sodio fosfato monobasico (NaH₂PO₄) e 0,2 M di fosfato di sodio bibasico (Na₂HPO₄·7H₂O) in deionizzata H₂O.
2. Compongono il 100 mL di tampone fosfato pH 7,0 Sorenson. Per pH 7.0, aggiungere 19,5 mL brodo di NaH₂PO₄ , 30,5 mL di NaHPO₄·7H₂O brodo e 50ml deionizzata H₂O.
3. Pesare il materiale di 25 mg al suolo del kernel (peso fresco, FW) e posto in un tubo del microcentrifuge 1,0 mL. Aggiungere 500 µ l di tampone fosfato alla provetta da centrifuga e vortexare per 30 s.
4. Centrifugare i campioni a 16.000 x gper 15 minuti. Surnatante µ l di dispensare 100 in una piastra ben nero 96. Leggere i campioni con un fluorimetro (eccitazione 485 nm, emissione 528 nm).

7. analisi di aflatossina totale

1. Estrazione di elaborazione e aflatossina Sample
   1. Asciugare i campioni del kernel in un forno ad aria forzata per 2 giorni a 60 ° C. Pesare i campioni e posto in una beuta con un tappo di vetro di 50 mL.
   2. In una cappa, aggiungere 25 mL di cloruro di metilene in ciascuno dei palloni.
      Attenzione: Il cloruro di metilene è altamente volatile ed è considerato pericoloso (irritante, cancerogeno). Guanti lattice né nitrile sono sicuri per l'utilizzo di cloruro di metilene. Utilizzare guanti di polivinilalcol resistente ai solventi organici migliorata.
   3. Agitare i campioni per 30 minuti su un agitatore di azione del polso. Dopo 30 min, versare lentamente l'estratto attraverso un cerchio di carta da filtro scanalate in un becher da 80 mL. Lasciate che il pernottamento asciutto di bicchieri in una cappa aspirante.
   4. Il giorno successivo, squirt cloruro di metilene (circa 5 mL) intorno alla parte interna dell'orlo dei bicchieri asciutti, turbinano attorno e versare in fiale di vetro 2 dram. Fiale di lasciare aprire ad per asciugare durante la notte in una cappa aspirante.
2. Analisi di aflatossina
   1. Aggiungere 4,0 mL 80% di metanolo: deionizzata H₂O (v/v) di fiale.
   2. Utilizzare un kit di estrazione di aflatossina per filtrare purificare soluzione di metanolo con la colonna specificata. Analizzare i livelli di aflatossina totale con un fluorimetro, secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

Trasformazione di mais e lo screening molecolare delle piante transgeniche

Embrioni immaturi di linee di mais Hi-II sono stati trasformati mediante Agrobacterium tumefaciens EHA101 ceppo contenente il vettore di destinazione finale pianta che esprimono il gene AILP Dolichos lablab sotto il controllo di CaMV 35S promotore. Cinque linee di mais in modo indipendente trasformate s...

Discussione

Perdite di rendimento dovute a colture agricole a causa di agenti patogeni e parassiti è un problema globale²⁰. Attualmente, applicazione dei fungicidi sintetici e pesticidi è il mezzo predominante per controllo impianto patogeni e parassiti, ma tossicità residua di queste sostanze biochimiche in alimenti e mangimi possono costituire grave minaccia per la salute umana e animale²¹. Considerando l'importanza economica del mais come alimento e mangime raccolto, riduzione o ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves	Ansell	012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera	Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 juice	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3	Fisher Scientific	09-820P
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific