Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni interne dal Institut Pasteur inclusa una sovvenzione Incitative (PTR 435) e da una sovvenzione "Contrat de Soutien à la Recherche" fornita da Sanofi Pasteur a Institut Pasteur. A. da Costa è stato sostenuto da Sanofi-Pasteur sovvenzione e Florian Bakoa è destinatario di una borsa di dottorato fornita da ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Siamo grati a Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florence Miller per utili discussioni.

1. cella lavoro della coltura di Ntera/CL2. D1 per preparare una co-coltura di hNeurons post-mitotici e hAstrocytes (NT2-n/a)
Nota: Questo è il componente di Minibrain (Figura 1).
<ol><li>Coltura del Ntera/Cl2.D1<ol>
<li>Rimuovere una fiala di cellule congelate dal serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.</li>
		<li>Scongelare le cellule rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.</li>
		<li>Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di ter...

In questo articolo abbiamo dimostrato come costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di misto cervello cellule cerebrali (Minibrain) in un unico kit. Questo sistema è biologicamente rilevanti, facile da impostare e gestire per gli sperimentatori ben addestrati nella coltura delle cellule.
Come per qualsiasi altro modello in vitro di BBB, otterrebbe risultati affidabili se drastica controllo di tenuta della barriera viene ...

Il cervello è separato dalla circolazione sistemica da una struttura non-permeabile che limita gli scambi tra parenchima del cervello e del sangue, chiamato emato - encefalica (BBB). Principalmente composto di cellule endoteliali cerebrali, la BBB dinamicamente interagisce con gli astrociti, microglia perivascolari e neuroni del parenchima cerebrale vicine. Le tre funzioni principali della BBB sono la creazione e il mantenimento dell'omeostasi ionica per funzioni neuronali, rifornimento del cervello con le sostanze nutrienti e protezione dalle lesioni tossiche o ingresso di agenti patogeni1,2, che contribuiscono alla il mantenimento della omeostasi del cervello e sue funzioni3. Questa barriera è così efficiente che solo pochi farmaci possono attraversare la BBB,4,5. Allo stato attuale, i metodi disponibili per predire se una molecola passa la BBB e diffuso nel cervello sono costituiti ex vivo studi sul monitoraggio di immagine materiale, autopsia del cervello di volontari umani di MRI (risonanza magnetica) o PET (emissione della posizione la tomografia) o farmacodinamica e farmacocinetici studi preclinici in animali6,7,8. Queste tecniche e modelli hanno alcune limitazioni, come la risoluzione limitata dell'animale domestico e la bassa sensibilità di MRI6,8, la difficoltà di quantificare molecole (cioè, le molecole dell'anticorpo basato per esempio) che male penetrare il cervello7e per il preclinici studia il loro costo elevato e la località di sperimentazione animale.
L'ultimo punto è importante perché, secondo il 3R regole, (sostituzione, affinamento e riduzione dei test sugli animali) le amministrazioni di regolamentazione hanno chiesto che i ricercatori sviluppano urgentemente scientificamente accurata alternativa all'animale sperimentazione9,10,11,12,13,14,15.
Negli ultimi decenni, diversi modelli in vitro di BBB sono stati proposti16,17,18 coltivando il filtro membrana inserisce le cellule endoteliali da diverse specie come il mouse, ratto, bovino e suino. Per quanto riguarda la specie umana, la disponibilità di scarsa e difficile di cellule primarie richiesto ai ricercatori di sviluppare modelli umani basati su cellule endoteliali immortalizzate cervello o cellule staminali umane19,20, 21. Queste barriere sono surrogati corretto in vitro di BBB a condizione che esprimono gli indicatori delle cellule endoteliali, marcatori di stretta della giunzione, trasportatori di efflusso, vettori soluti, recettori e rispondere a stimoli endoteliale 20. Alcuni modelli BBB utilizzando filtro membrana inserti rivestiti da cellule endoteliali e altri tipi di cellule (cioè, gli astrociti, neuroni o periciti22,23,24) sono stati analizzati. L'obiettivo di queste co-culture era di aumentare le caratteristiche fisiche di BBB, approfittando della secrezione di fattori solubili da astrociti/neuroni o periciti.
Tuttavia, nessuno di questi modelli include il parenchima cerebrale per studiare e prevedere il destino di un candidato della droga una volta ha superato la barriera. Di conseguenza, il nostro obiettivo era quello di costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di cellule cerebrali miste in un unico kit. Il BBB-Minibrain utilizza un sistema di cultura costituito da un filtro poroso inserito in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule del multiwell. Il filtro è ricoperto con cellule hCMEC/D3, una linea di endothelial delle cellule di cervello umano che è stata dimostrata altamente affidabile per droga BBB test25,26,27, per formare la BBB. Il Minibrain, che è una cultura co-differenziata dei neuroni umani e astrociti derivati dal NTera/Cl2.D1 cella linea28,29 misto insieme con la linea cellulare umana microglial CHME/Cl530 in rapporto corrispondente alla microglia vs rapporti di neuroni-astrociti del cervello31, è coltivata anche nella parte inferiore della piastra.
Oltre a studiare il passaggio di farmaci attraverso la barriera emato-encefalica e il loro destino nel parenchima, l'interfaccia di emato-encefalica in cellulo modello potrebbe essere un potente strumento per affrontare l'ingresso di agenti patogeni nel cervello (neuroinvasiveness), la dispersione nel cervello (neurotropism) e la tossicità (neurovirulence) che possano esercitare sulle cellule di parenchima del cervello. Studi neurovirulence e neuroinvasiveness sarebbero beneficiare dello sviluppo di un efficiente modello di cellulo ed essere vantaggioso sostituire modelli animali. Utilizzando il kit di BBB-Minibrain32, abbiamo dimostrato il fenotipo neuroinvasive di rari mutanti virali che accumulato nel ceppo di virus neurotropi francese del Virus della febbre gialla (vale a dire, FNV-YFV33,34) utilizzato per preparare un interrotto il vaccino vivo YFV e il passaggio di una biomolecola neuroregenerative e neuroprotective, chiamato Neurovita (d'ora in poi denominato NV nel manoscritto)35. Perché NV né naturalmente attraversa la membrana delle cellule, né la BBB, NV è stata fusa con la parte variabile (VHH) di un anticorpo di singola catena di lama che attraversa le membrane biologiche, tra cui la BBB e funziona come una cella penetrante molecola (CPM)36. La proprietà CPM di VHH sembra dipendere il punto isoelettrico e la lunghezza dei VHH37.
Questo test cellulo dovrebbe rendere possibile ordinare le molecole che potenzialmente potrebbero attraversare la BBB prima realizzazione di farmacocinetica e farmacodinamica analisi negli animali e idealmente nello stesso tempo essere in grado di prevedere il loro comportamento nel sistema nervoso parenchima. Questo sistema è biologicamente rilevanti e facile da impostare e gestire da professionisti ben addestrati in cella cultura26,29,30,38. L'interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: ridurre i costi di test preclinici su una mano e riducendo l'uso di sperimentazione animale d'altra parte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluoro-2&#8217;deoxyuridine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85mm Petri Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3902-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nf200</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercapto-ethanol</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHME/Cl5</td>
			<td>Unit&#233; de Neuroimmunologie Virale</td>
			<td>On request to Dr Lafon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>217274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogro IV</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCME004</td>
			<td>endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>529121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30015-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIEMSA</td>
			<td>RAL Diagnostic</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Ca2+-Mg2+</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMEC/D3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLU512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15630-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>33263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>L6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 10X</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>42360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ntera/Cl2D.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+-Mg2+</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Ca2+-Mg2+</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CXXPES00-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-Lysine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiashredder</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Collagen I</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3443-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid All-Trans</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate 5.6%</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CXXBIC00-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell+ Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-1813-302</td>
			<td>Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td>polyester porous membrane culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Water</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFV-FNV</td>
			<td>IP Dakar</td>
			<td>Vaccine vial</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human blood-brain interface model to study barrier crossings by pathogens or medicines and their interactions with the brain

I primi screening di farmaci del sistema nervoso su un pertinenti e affidabile nel modello BBB cellulo per la loro penetrazione e loro interazione con la barriera e il parenchima cerebrale è ancora un bisogno insoddisfatto. Per colmare questa lacuna, abbiamo progettato un 2D in modello cellulo, il BBB-Minibrain, combinando un poliestere membrana porosa cultura inserto umano BBB modello con un Minibrain formato da un tri-coltura di cellule di cervello (neuroni, astrociti e microglia). Il BBB-Minibrain ci ha permesso di testare il trasporto di un candidato della droga neuroprotective (ad esempio, Neurovita), attraverso la BBB, per determinare il targeting specifico di questa molecola ai neuroni e per mostrare che la proprietà neuroprotective della droga è stata conservata dopo la droga aveva attraversato la BBB. Abbiamo anche dimostrato che BBB-Minibrain costituisce un modello interessante per rilevare il passaggio di particelle del virus attraverso la barriera di cellule endoteliali e per monitorare l'infezione del Minibrain di particelle del virus neuroinvasive. Il BBB-Minibrain è un sistema affidabile, facile da gestire per ricercatore addestrati nella tecnologia di coltura cellulare e predittiva dei fenotipi di cellule di cervello dopo il trattamento o insulto. L'interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: l'introduzione di derisking passaggi precocemente durante lo sviluppo di droga da un lato e riducendo l'uso di d'altra parte la sperimentazione animale.

Il BBB-Minibrain è un cellulo in sperimentale modello di interfaccia sangue-cervello.
Il BBB-Minibrain è impostato sull'apparato di inserto cultura di membrana in poliestere per imitare un compartimento sangue al piano superiore e un cervello al livello inferiore dell'interfaccia sangue-cervello (Figura 2AB). Si compone di un vano luminal con le cellule endotelial...

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A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

Qui presentiamo un protocollo che descrive l'impostazione di un cellulo in BBB (barriera ematoencefalica)-cultura di poliestere membrana porosa Minibrain inserire il sistema al fine di valutare il trasporto di biomolecole o agenti infettivi attraverso un Bee umano e loro impatto fisiologico sulle cellule cerebrali adiacenti.

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Questo modello di interfaccia sangue-cervello umano è utile per studiare il trasferimento di molecole nel sistema neurologico. Così come per lo studio dei microbi raggiungere un tumore al dolore cerebrale infetto. L'aggiunta del mini cervello a questa barriera ematica o modello BBB consente lo studio dei nostri agenti patogeni e molecole che causano il comportamento della BBB nel cervello.A demostrare la procedura sarà Florian Bakao, dottorando del mio laboratorio. Per impostare un mini dispositivo di inserimento della membrana in poliestere cerebrale BBB, diluire le cellule a un mezzo cellulare endoteliale incompleto di concentrazione cinque volte 10 alla quarta e aggiungere il volume appropriato di cellule a ciascuna coltura di membrana poliestere in una piastra di 12 pozzo. Quindi, posizionare gli inserti e l'incubatore di coltura cellulare fino a quando le celle non raggiungono il 100% di confluenza.Tenere una piastra di 12 pozzetti con un millilitro di poli-D-llysina bene per quattro ore a temperatura ambiente. Seguito da un millilitro di laminina per pozzo durante la notte. Sostituire la laminina con un millilitro di mezzo cellulare endoteliale integrato con siero bovino fetale al 5% o FBS.Posizionare il posto in un'incubatrice per un'ora. Per preparare il mini grano tripinare delicatamente gli astrociti dei neuroni umani nel chme clonare cinque cellule. Associare i pellet cellulari al mezzo cellulare endoteliale completo.Dopo aver contato a 3,6 per 10 al quinto neurone e astrociti a 0,4 per 10 al quinto clone CHME cinque cellule per pozzo hanno una piastra di pozzo 12. E semina il piatto di 12 pozzi. Per costruire il mini cervello BBB 24 ore dopo la semina sostituire il mezzo usato con un nuovo mezzo cellulare endoteliale completo e trasferire la coltura di membrana in poliestere rivestita di cellule endoteliali micro vascolari cerebrali inserti sulle mini cellule cerebrali.Quindi, posizionare la BBB molti dispositivi cerebrali nell'incubatore. Per convalidare la mini permeabilità endoteliale cerebrale BBB aggiungere 1,5 millilitri di tampone di trasporto per pozzo a una nuova piastra da 12 pozza. E capovolgere ogni filtro per rimuovere con cura il mezzo senza influire sulla barriera cellulare endoteliale.Posizionare ogni filtro in un pozzo della piastra riempita del tampone di trasporto e aggiungere 0,5 millilitri di giallo Lucifero in ogni pozzo. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per 10 minuti prima di trasferire i filtri in un nuovo tampone di trasporto riempito con 12 piastre di pozzo. Dopo aver istituito un BBB molti dispositivi cerebrali come dimostrato, aggiungere 3500 unità platform del ceppo di virus neurotrofico francese del virus della febbre gialla diluito e 50 microlitri del mezzo cellulare endoteliale 2%FPS, con molta attenzione, sopra il compartimento luminale.Inoculare il mini cervello BBB di controllo con 50 microlitri di mezzo cellulare endoteliale FBS al 2% senza virus. Quindi posizionare il virus esporre BBB molti dispositivi cerebrali nell'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere gli inserti per determinare la permeabilità della cellula endoteliale e un compagno, così come dimostrato.Salvare un millilitro di campione da ogni pozzo per determinare il formicolio del virus nel compartimento centrale. Sotto l'inserto delicatamente per evitare perdite del compartimento luminale nei compartimenti abluminali. Per studiare il trasporto di un neurone che mira biomolecolare attraverso la barriera eculare, aggiungere la bio molecola di interesse agli inserti e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.Dopo 24 ore da remoto si inserisce e determina la permeabilità endoteliale. Quindi macchiare le molte cellule cerebrali con l'anticorpo appropriato per rilevare la presenza della bio molecola di interesse all'interno del mini cervello. Le cellule endoteliali micro vascolari cerebrali umane esprimono tutti i sottoinsiemi di rececptor, trasportatori Efflux o trasportatori che sono proteine rilevanti chiave per le loro funzioni biologiche.Alcuni ceppo di virus neurotropicali francesi del virus della febbre gialla possono attraversare la barriera eencefalica a 24 ore. I virus si amplificano quindi per i prossimi due giorni moltiplicando il virus all'interno delle cellule cerebrali. Inoltre, l'espressione di specifici biomarcatori virali viene stimolata quando questa popolazione virale neuronvasiva viene serialmente travasata sulle mini cellule cerebrali e strettamente correlata alla carica virale.Dopo essere stato aggiunto al limite della molecola penetrante delle cellule compartimentali Neuro-Tag Neurovita attraversa la barriera eencefalica ed è in grado di colpire i neuroni umani. Molecola penetrante cellulare neuro tag Delta neurovita attraversa la barriera cellulare endoteliale, ma prende di mira in modo meno efficiente i neuroni umani. Dopo essere stato aggiunto al piccolo compartimento centrale, la molecola penetrante cellulare Neuro-Tag Neurovita attraversa la barriera eencefalica ed è in grado di rigenerare gli assoni dei neuroni umani, dopo il mento.In contrasto con la molecola penetrante cellulare Neuro-Tag Neurovita Delta, la forma inattiva di Neurovita. Se applicato dopo che la cellula graffiante dell'assone penetrante Molecola Neuro-Tag Neurovita innesca la neuroprotezione dei neuroni feriti e la rigenerazione zonale x. Rigorosamente per il bene delle pratiche.non usare es oltre i passaggi a I-cell. Cerca di mantenere una parvenza di medie e regioni e controlla l'assenza di micoplasma. Le interazioni tra il mini cervello e i farmaci sono microbi di interesse possono essere ulteriormente studiate per trascrizione che chimichezzano questa o biologia classica chiamata tecniche.

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

Abstract