וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

השימוש של תאים hiPSC, נגזר מייצג בגישה יקר ללמוד מחלות ניווניות אנושי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטב עבור הבידול של hiPSCs נגזר מטופל עם triplication של אלפא-synuclein ג'ין (SNCA) מיקומה לתוך מחלת פרקינסון (PD)-אוכלוסיות עצביים וכולינרגיים הרלוונטיים. לצבירת ראיות הראה כי רמות גבוהות של SNCA הם סיבתי לפיתוח של הכרה PD. קליניות צריכים לייסד רומן גישות טיפוליות עבור PD, במיוחד אלה מיקוד ברגולציה של ביטוי SNCA , אנחנו לאחרונה פיתחה מערכת CRISPR/dCas9-מתילציה-מבוסס DNA epigenetically לווסת שעתוק SNCA על ידי העשרת רמות מתילציה האזור רגולטוריות אינטרון 1 SNCA . כדי לספק את המערכת, המורכב מת (שהפעלתם בוטלה) הגירסה של Cas9 (dCas9) התמזגו עם המחשבים קטליטי של 3A אנזים methyltransferase ה-DNA (DNMT3A), וקטור lentiviral משמש. מערכת זו חלה על תאים המכילים triplication של לוקוס SNCA ומקטין את SNCA-mRNA ואת רמות החלבון בכ 30% באמצעות מתילציה DNA יישוב של אינטרון SNCA 1. Downregulation מכויל של רמות SNCA מציל הקשורים למחלות פנוטיפים הסלולר. בפרוטוקול הנוכחי, אנו שואפים לתאר את הליך שלב אחר שלב עבור המבדילים hiPSCs לתוך ובתאים עצבית (NPCs) ואת הממסד אימות של מבחני pyrosequencing על ההערכה של הפרופיל מתילציה SNCA אינטרון 1. חלוקה לרמות ביתר פירוט את המערכת lentivirus-CRISPR/dCas9 שימוש בניסויים אלה, פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר ולטהר, להתרכז וקטורים lentiviral כדי לסמן להתאמתם עבור epigenome ואת הגנום-יישומים לעריכת באמצעות hiPSCs ו- NPCs. הפרוטוקול ניתנת להתאמה בקלות והוא יכול לשמש כדי לייצר כייל נוגדנים גבוה lentiviruses ליישומים במבחנה ויוו.