Disección de Local Ca^{2 +} señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca^{2 +} indicadores

Ion calcio (Ca^{2 +}) es una molécula de mensajero intracelular universal que impulsa múltiples vías de señalización, a diversos productos biológicos. La coordinación de dos fuentes de Ca^{2 +} señal — «Ca^{2 +} afluencia"de fuera de la célula y"Ca^{2 +} lanzamiento"de la Ca2 + intracelular retículo endoplasmático (ER), se considera que subyacen a los diversos patrones espacio-temporales de Ca ^{2 +} señales que provocan múltiples funciones biológicas en las células. El propósito de este protocolo es describir un nuevo Ca^{2 +} método de imagen que permite la monitorización del momento de "Ca^{2 +} afluencia" y "Ca^{2 +} en libertad". REA-GCaMP6f es un genéticamente codificados Ca^{2 +} indicador (GECI) compuesto por GCaMP6f, que está dirigido a la membrana externa de ER. REA-GCaMP6f puede controlar Ca^{2 +} lanzamiento en una mayor resolución temporal que GCaMP6f convencionales. Combinado con GECIs orientada en la membrana plasmática, el espacio-temporal Ca^{2 +} patrón de señal puede ser descrito en una resolución subcelular. El objetivo subcelular Ca^{2 +} indicadores descritos aquí son, en principio, disponible para todos los tipos de células, incluso para el vivo en proyección de imagen de las neuronas de los elegans de Caenorhabditis . En este protocolo, introducimos el Ca^{2 +} proyección de imagen en células de líneas de células, neuronas y glía en cultivos primarios disociados y describir la preparación de caldo congelado de neuronas corticales de rata.