Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Gli esosomi e altre vesciche extracellulari (EV) sono complessi molecolari costituiti da una vescica della membrana lipidica, la sua decorazione superficiale da proteine della membrana e altre molecole, e diversi contenuti luminali ereditati da una cellula madre, che include RNA, proteine e DNA. La caratterizzazione delle dimensioni idrodinamiche dei VE, che dipende dalle dimensioni della vescica e dal suo strato coronale formato da decorazioni superficiali, è diventata di routine. Per gli esosomi, il più piccolo dei VE, la differenza relativa tra le dimensioni idrodinamiche e vescicle è significativa. La caratterizzazione delle dimensioni delle vesciche mediante l'imaging criogenico elettronico (crio-TEM), una tecnica gold standard, rimane una sfida a causa del costo dello strumento, delle competenze necessarie per eseguire la preparazione del campione, l'imaging e analisi dei dati, e un piccolo numero di particelle spesso osservate nelle immagini. Un'alternativa ampiamente disponibile e accessibile è la microscopia a forza atomica (AFM), in grado di produrre dati versatili sulla geometria tridimensionale, le dimensioni e altre proprietà biofisiche delle vesciche extracellulari. Il protocollo sviluppato guida gli utenti nell'utilizzare questo strumento analitico e delinea il flusso di lavoro per l'analisi dei veicoli elettrici da parte dell'AFM, che include la preparazione del campione per l'imaging dei vee EV in forma idratata o desiccata, l'immobilizzazione elettrostatica su un substrato, l'acquisizione dei dati, la sua analisi e interpretazione. I risultati rappresentativi dimostrano che la fissazione dei verisulla superficie mica modificata è prevedibile, personalizzabile e consente all'utente di ottenere risultati di dimensionamento per un gran numero di vesciche. Il dimensionamento della vescica basato sui dati AFM è risultato coerente con l'imaging crio-TEM.