Wir danken Dr. Seth Robia Loyola University Chicago für seine wertvollen Anmerkungen zu dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde von NIH Grant 1R01NS073967-01A1 zu Joanna C. Bakowska unterstützt.

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Wir bieten eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen. Hier das Protokoll wurde verwendet, um die Mobilität der YFP-p62 in ALIS in RAW264.7 Makrophagen zu messen, aber es kann auf viele der Laserscanning confocal Mikroskop-Systeme angewendet werden und genetisch codierte fluoreszierende Proteine, die jetzt verfügbar sind. Für jedes Mikroskopie-System sind Pilotversuchen entscheidend für die Bestimmung der optimalen FRAP-Parameter, einschließlich Erwerb, Bleichmittel und Kontrolle ROI Größen Laserintensität für Immunofluoreszenz und prebleach und postbleach Bildaufnahme. Es ist sinnvoll, die optimale FRAP-Parameter für jede genetisch codierte fluoreszierende Protein und Zelle Linie abweichen zu erwarten.
Wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Durchführung eines Experiments FRAP umfassen (a) erreichen geeignet bleichen Tiefe, (b) die Verwendung von einem kurzen bleichen Schritt (c) so dass genügend Zeit Postbleach zu beobachten, die vollständige Wiederherstellungsfunktion, (d) Immunofluoreszenz Effizienz, (e). Zytotoxizität mit wiederholten FRAP und (f) die Aufnahme eines Steuerelements für Fluoreszenz-Verlust wegen wiederholter Bildgebung. Es wird empfohlen, Tiefe, Bleichmittel, die gemäß der in Abschnitt 3.3.1 bereitgestellten Gleichung berechnet werden kann, ≥9013Jahre alt sein. Als Bleichmittel Tiefe ist < 90, der Grad der postbleach Fluoreszenz Erholung wird unterschätzt werden, und die Werte von IfMfund t1/2 werden falsch. Obwohl die Dauer und Intensität der Laserpulse Bleichmittel-induzierende zwischen FRAP Experimente variieren, ist es wichtig, dass die Immunofluoreszenz Schritt kurz und deutlich schneller als der Fluoreszenz-Recovery-Funktion. Wenn es nicht ist, könnte eine erhebliche Menge an Fluoreszenz Erholung während der Bleiche Schritt auftreten. Mit einer langen Bleichmittel, Fluoreszenz Erholung während der Bleiche Schritt nicht gemessen werden, und es würde führen zu Fehlmessungen von If, M,f, undt1/2. Darüber hinaus, um korrekte Werte zu erhalten für If, M,f, undt1/2, mit dem ROI beachtet werden postbleach bis die Fluoreszenz in der Bleiche ROI ein Plateau erreicht hat. Zum Beispiel in unseren Experimenten FRAP gab es keinen Unterschied zwischen dem ichf, M,fund t1/2 Werte wenn wir YFP-p62 Fluoreszenz in der Bleiche ROI 32,2 min postbleach beobachtet gegenüber wenn wir YFP-p62, in der Bleiche ROI beobachtet für 15,1 min Postbleach; So schlossen wir, dass die Recovery-Funktion ein Plateau bei 15,1 min postbleach12erreicht. Im Hinblick auf Immunofluoreszenz Effizienz erhöht Immunofluoreszenz mit dem Quadrat der optische Zoom Faktor14. Somit ist die Verwendung von hohen optischen Zoom-Objektive ist günstig für schnelle Immunofluoreszenz aber unerwünschte Immunofluoreszenz während der Akquisition führen kann; Letztere können berücksichtigt werden durch bildgebende ein Steuerelement ROI. Wiederholte Immunofluoreszenz soll vermieden werden, da es zu der Generation von zytotoxisch reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führen kann. Jedoch der Grad der ROS-Generation aufgrund der Exposition gegenüber einem Hochleistungs Laser ist geringer bei genetisch codierte fluoreszierende Proteine als chemische Fluorophore (z. B. fluoreszierende Antikörper)15, und der ROS erzeugt eher reagieren innerhalb der genetisch codierten fluoreszierenden Proteins als mit anderen Molekülen in der Zelle4. Neben der erhöhten Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von zytotoxischen ROS soll wiederholte Immunofluoreszenz vermieden werden, da es schwer zu kontrollieren ist. Schließlich obwohl niedrige Laser Übertragung verwendet wird, um alle nicht-Bleichmittel Bilder zu erwerben, wird einige Immunofluoreszenz unweigerlich auftreten, muss kontrolliert werden. Mögliche Kontrollen dafür gehören Überwachung Fluoreszenz in einem Steuerelement ROI innerhalb der Erwerb ROI, Erlangung der Kontrolle Bilder in eine Nachbarzelle ungebleicht und Kontrolle experimentieren mit identischen Einstellungen für die in der Immunofluoreszenz-Experimente, aber ohne das Immunofluoreszenz-Ereignis.

Fluoreszenz-Recovery nach Immunofluoreszenz (FRAP) eine Mikroskopie-Technik, die verwendet werden können ist, zu quantifizieren Proteindynamik Live Zellen1,2. Die Popularität der FRAP aufgrund der weit verbreiteten kommerziellen Verfügbarkeit von Laser-scanning-konfokale Mikroskope mit hoher Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit zugenommen hat, und ein "Regenbogen" von genetisch codiert fluoreszierende Proteine, wie z.B. Grün fluoreszierend Protein (GFP) und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP)3. Genetisch codierte fluoreszierende Proteine sind an ein Protein des Interesses für die subzelluläre Lokalisation des Proteins des Interesses ermöglichen fusioniert. In einem typischen FRAP-Experiment wird die Steady-State Fluoreszenz in einer Übernahme Region of Interest (ROI) innerhalb einer Zelle über wiederholte Darstellung der diese Rendite mit Laserlicht niedriger Intensität beobachtet. Anschließend sind die fluoreszierenden Moleküle in eine vordefinierte Teilmenge des Erwerbs ROI, nachstehend das Bleichmittel ROI, durch kurze hochintensive Laser Lichteinwirkung rasch und irreversibel beeinträchtigt. Als neue ungebleicht Proteine gebleichten Proteine im Laufe der Zeit wieder aufzufüllen, informiert die Geschwindigkeit und die Intensität der Fluoreszenz-Erholung in der Bleiche ROI über Protein Mobilität (Abbildung 1)4.
Unser Interesse an der Ermittlung der Mobilität von Ubiquitin bindende Protein p62 (auch bekannt als Sequestosome-1) in Aggresome-induzierten Strukturen (ALIS) in murinen RAW264.7 Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) uns zur Überprüfung der FRAP führte Literatur. Leider sind viele der vorhandenen FRAP Protokolle unvollständig oder übermäßig komplex5,6,7,8,9. Einige bieten keine detaillierte Informationen über die Lasereinstellungen, Strahl Weg Konfiguration und Bild Erwerb Parameter5,6,7,8,9. Andere wichtige Details zur Datenanalyse, z. B. wie man das Problem der Bleichmittel ROI Drift6,9 oder wie wichtig Wiederherstellungsparameter, einschließlich der mobilen Bruchteil (M-f), unbeweglich Bruchteil berechnen weggelassen (Ichf), und Halbzeit-Wiederherstellung (t½)5,7. Umgekehrt, andere zuviel Schwerpunkt auf komplexen mathematischen Formeln zur Berechnung von M-f, ichfund t1/25,6,8,9. Somit ist unser Ziel, eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen bieten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) ist eine Mikroskopie-Technik, die verwendet werden kann, um Protein Mobilität in lebenden Zellen zu quantifizieren. In einem typischen FRAP-Experiment wird durch wiederholte Bildgebung mit niedriger Intensität Laserlicht stationären Fluoreszenz beobachtet. Anschließend sind die fluoreszierenden Molekülen über kurze hochintensive Laser Lichteinwirkung rasch und irreversibel beeinträchtigt. Informationen über Protein Mobilität ergibt sich durch die Überwachung der Erholung der Fluoreszenz. Wir gewohnt FRAP, um die Mobilität der p62 in Aggresome-induzierten Strukturen (ALIS) in murinen Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) zu bestimmen. Da viele vorhandene FRAP Protokolle entweder unvollständig oder komplex sind, war unser Ziel, eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen zur Verfügung zu stellen. Hier beschreiben wir RAW264.7 Makrophagen Transfektion mit gelb fluoreszierende Protein-p62 (YFP-p62), Induktion von ALIS indem man die Zellen LPS und eine schrittweise Methode für das Sammeln von prebleach und postbleach FRAP Bilder und Datenanalyse. Schließlich diskutieren wir wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Sie eine FRAP-Experiment durchführen.

Hier sind die Ergebnisse der ein typisches Experiment, in dem wir FRAP verwendet, um den Grad der Mobilität der p62 in ALIS in RAW264.7 Zellen behandelt mit LPS für 3-5 h12zu untersuchen. Abbildung 3 A zeigt die rohen Daten aus ein Bleichmittel, Steuern und Hintergrund ROI, nachdem der Stapel von Bildern angeglichen hatte, um für Kleinbeträge zu korrigieren (< ~ 3 µm) Bild Drift von der ALIS. YFP-p62 Fluoreszenz in diesem ALIS an Prebleach und Postbleach ist in Abbildung 3E und ergänzende Video 1gezeigt. Abbildung 3 B zeigt diese Daten nach der Hintergrund-Korrektur. Abbildung 3 C zeigt diese Daten nach der Korrektur Fluoreszenz im Steuerelement ROI. Abbildung 3 D zeigt diese Daten auf die mittlere Fluoreszenz der 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI normalisiert. Der Grad der bleichen reichte in diesem Experiment (Bleichen Tiefe = 91.94). YFP-p62 Fluoreszenz innerhalb dieses ALIS erholte sich langsam, als t1/2 = 128.27 s (2,14 min). YFP-p62 war kein sehr mobiler Protein in diesem Experiment als Mf = 21.97 und If = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Abbildung 1 : Ein Diagramm mit einer RAW264.7 Zelle und Schritte für die Bildanalyse nach Behebung für Drift-Bild von der ALIS FRAP Bilder ausgerichtet wurden. (A) schematische Darstellung einer RAW264.7 Zelle Darstellung mehrere ALIS und der Bleiche, Kontrolle und Hintergrund ROIs im Rahmen der Akquisition ROI. (B) eine idealisierte Darstellung des rohen FRAP Daten erhalten die Bleichmittel, Steuerung, als auch im Hintergrund ROIs Panel A. (C) eine idealisierte Grafik der FRAP-Rohdaten, die Hintergrund-korrigiert wurden. (D) eine idealisierte Grafik von Hintergrund-korrigierte FRAP-Daten, die auf Fluoreszenz im Steuerelement ROI normalisiert haben. (E) eine idealisierte Grafik des normalisierten und Hintergrund-korrigierte FRAP-Daten, die auf die prebleach Fluoreszenz in der Bleiche ROI normalisiert haben. Abkürzungen: Con = Kontrolle; BG = Hintergrund. Diese Zahl wurde von Rabut und Ellenberg4geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Abbildung 2: Bilder der Benutzeroberfläche in der Ziel-Software (Table of Materials) für die Laser-Auswahl, breite Weg Konfiguration und Erwerb Bildparameter für die FRAP Experimente. (A) Laser steuern Bildschirm zeigt das Argon/2 Laserlinien, Ausgabe und Röhrenstrom verwendet. (B) Konfiguration steuern Bildschirm zeigt den Strahl Splitter und Emission Filtereinstellungen verwendet. (C) Bild steuern Bildschirm zeigt die Einstellung für die Bildaufnahme verwendet. (D) Scan steuern Bildschirm zeigt die Lochkamera, Detektor Gewinn, Verstärker Offset, Verstärkungsfaktor und Getriebeeinstellungen für Argon/2 514 nm Laserlinie. (E) Time-Serie kontrollieren Bildschirm zeigt die Zeiteinstellungen Serie verwendet. (F) Bleach steuern Bildschirm zeigt die Prebleach und postbleach Parameter verwendet. Abkürzungen: HFT = Haupt-Farb-Teiler (primäre dichroitischer Strahlteiler); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (erste sekundäre dichroitischen beam Splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (zweiter sekundäre dichroitischer Strahlteiler); EF = Emission Filter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Abbildung 3 : Eine repräsentative FRAP-Experiment, YFP-p62 Dynamik in ALIS in RAW264.7 Zellen zu studieren. (A) Raw Fluoreszenz Intensitätsdaten für ein Bleichmittel, Kontrolle und Hintergrund ROI. (B) die Angaben in zentrale A nachdem die Bleichmittel und Kontrolle ROI für Fluoreszenz im Hintergrund ROI berichtigt worden. (C) die Daten nach Normalisierung der Fluoreszenzintensität in das Bleichmittel ROI zu Konto für Fluoreszenz im Hintergrund-korrigierte Steuerelement ROI in Platten A und B gegeben. (D) die Angaben in A-C-Panels nach Normalisierung der Fluoreszenzintensität im normalisierten und Hintergrund-korrigierte Bleichmittel ROI auf den Durchschnitt der ersten 5 prebleach Werte in das Bleichmittel ROI. Mf = 21.97, ichf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) und Bleichmittel Tiefe = 91.94. (E) ein Bild von einem ALIS Prebleach (1,5 min) und Postbleach (0, 6 und 16 min.). Maßstabsleiste = 5 µm und gilt für alle Paneele. Abkürzungen: Con = Kontrolle; BG = Hintergrund; Korr. = korrigiert; Norm. = normalisiert; Ø = Durchschnitt. Diese Zahl wurde von Cabe Et Al.12geändert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Ergänzende Video 1: eine typische ALIS in einem RAW264.7 Makrophagen vor und nach Immunofluoreszenz. YFP-p62 Fluoreszenz ist langsam zum erholen nach der Photobleach; p62 ist daher nicht sehr mobil Protein. Für dieses Experiment, Mf = 25.62, ichf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) und Bleichmittel Tiefe = 90.19. Maßstabsleiste = 5 µm. Dieses Video wurde von Cabe Et Al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier geändert, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen

Wir beschreiben ein umfassendes und praxisnahes Protokoll für die Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Immunofluoreszenz Experimente mit Zellen Leben. Obwohl das Protokoll verwendet wurde, um die Mobilität der gelb fluoreszierende Protein-Tags p62 in Aggresome-induzierten Strukturen zu messen, kann es zu einer Vielzahl von Mikroskopiesysteme und fluoreszierende Proteine angewendet werden.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Vorhandene Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleicharbeiten, FRAP-Protokolle, sind entweder unvollständig oder übermäßig komplex. Das in diesem Video vorgestellte Protokoll ist insofern von Bedeutung, als es umfassend, praktisch und unkompliziert ist. Der Hauptvorteil dieser FRAP-Technik besteht darin, dass sie die Quantifizierung der Proteinmobilität innerhalb und zwischen subzellulären Kompartimenten in lebenden Zellen ermöglicht.FRAP wird sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen Zwecken untersucht. Eine solche Verwendung besteht darin, die Diffusion innerhalb von Arzneimittelabgabesystemen in verschiedenen Geweben in vivo zu quantifizieren. Diese Informationen können verwendet werden, um eine Arzneimittelstruktur und -zusammensetzung zu optimieren.Die FRAP-Mikroskopietechnik hat Einblicke in ein breites Spektrum von Bereichen geliefert, in denen das Verständnis von Diffusionsphänomenen von Interesse ist. Dazu gehören Zell- und Molekularbiologie, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften, Materialwissenschaft, fortgeschrittene Biomaterialien und Arzneimittelforschung. Obwohl das beschriebene Protokoll für die Verwendung mit Säugetierzellen vorgesehen ist, können die Konzepte auf andere Systeme wie Pflanzenzellen, Hefezellen und Bakterien angewendet werden.Eine Person, die diese Technik noch nie durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, die optimalen Bildaufnahmeparameter zu bestimmen, eine Fürstgeeignete Erfassungsregion zu schaffen und den mobilen Bruchteil und die Halbzeit der Wiederherstellung zu berechnen. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, sollten Sie mehrere Pilotversuche durchführen, um das Protokoll im Kontext der Ziele Ihres Experiments zu optimieren. Das Verfahren wird Maleen Cabe, ein Techniker aus meinem Labor, und David Rademacher, der Zentrale für Bildgebungs-Einrichtungsleiter, demonstrieren.Bereiten Sie zunächst eine Platte mit YFP-p62 transfizierten RAW264.7-Makrophagen vor und behandeln Sie sie mit Lipopolysaccharid, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als nächstes spülen Sie die behandelten Zellen einmal mit dem eiskalten Tyrodes Puffer ab. Fügen Sie dann zwei Milliliter Nocodazol-ergänzten Tyrodes Puffer auf die Platte, und lassen Sie die Platten bei vier Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten vor FRAP-Bildgebung und Analyse inkubieren.Lassen Sie die Platten bei vier Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten vor FRAP-Bildgebung und Analyse inkubieren. Wählen Sie bei der Bildgebung die 514-Nanometer-Linie des Argon/2-Lasers aus, da der Fluoreszenzmarker eine Spitzenanregung von 512 Nanometern und eine Spitzenemission von 527 Nanometern hat. Klicken Sie im Fenster Lasersteuerung auf Argon/2, 458, 477, 488, 514, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Standby.Nachdem Sie etwa drei Minuten gewartet haben, bis sich der Laser erwärmt hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Ein. Stellen Sie dann die Laserleistung des Lasers auf 100% und drücken Sie Enter. Als nächstes stellen Sie die Übertragung der Laserlinie auf 5%Auf dem Mikroskop, drehen Sie auf die Plan-Apochromat 63x Vergrößerung 1,40 numerische Blende Ölobjektiv.Sehen Sie sich die Probe durch das Mikroskop-Okular an und platzieren Sie eine aggresome-ähnliche induzierte Struktur in der Mitte des Sichtfeldes. Legen Sie dann in der Erfassungssoftware die Framegröße auf 512 x 512 Pixel, die Scangeschwindigkeit auf acht und die Datentiefe auf 12 Bit fest. Legen Sie auch den Scandurchschnitt auf eins, den optischen Zoom auf drei und drücken Sie die Eingabetaste.Als nächstes, se das Loch auf 1,95 Fehlereinheiten und Detektor-Verstärkung auf 582, die knapp unter Sättigung ist. Erstellen Sie einen quadratischen Bereich von Interesse für die Bildaufnahme, der die Abmessungen 150 x 150 Pixel aufweist. Richten Sie die Zeitreihen so ein, dass die Interessenregion 35 Mal gescannt wird, einmal alle 30 Sekunden.Stellen Sie dann die Bleichmittelkontrolle so ein, dass die Photobleichung nach dem Scan Nummer fünf erfolgt, um fünf Vorbleichenbilder der Interessenregion zu sammeln. Drücken Sie die Eingabetaste, um sie zu bestätigen. Gehen Sie anschließend zum Fenster Bleichbereiche und erstellen Sie einen kreisförmigen Bleichbereich von Interesse innerhalb des aggresome-ähnlichen induzierten Strukturbereichs, der einen Durchmesser von 10 Pixeln hat.Legen Sie nun die Anzahl der Iterationen auf 300 fest, und drücken Sie erneut die Eingabetaste. Stellen Sie dann die Laserleitung auf 100 % Leistung ein, und geben Sie 100 in das Transmissionsprozentfeld für den Laser ein, und drücken Sie enter. Führen Sie schließlich das Bildaufnahmeprogramm aus, um FRAP-Daten von 10 aggresome-ähnlichen induzierten Strukturen in 10 Zellen mit weniger als drei Mikrometern Drift zu sammeln.Um mit der Datenanalyse zu beginnen, übertragen Sie zunächst die AIM-lsm-Dateien zur Datenanalyse auf einen PC. Korrigieren Sie die Bilddrift, indem Sie den Stapel von Zeitreihenbildern der Erfassungsregion ausrichten oder abgleichen, indem Sie jede AIM-lsm-Datei mit einem Bildverarbeitungsprogramm öffnen. Wählen Sie dann Plugins, Registrierung, StackReg und Übersetzung aus, gefolgt von Plugins, Registrierung, StackReg und dann Starrkörper.Als nächstes richten Sie den Bereichsmanager für Interesse ein, um die Signalintensität in der von Interesse kommenden Bleichregion zu messen. Wählen Sie dazu das ovale Werkzeug aus, zeichnen Sie dann einen Kreis im von Interesse beschaffenen Bleichbereich mit einem Durchmesser von 10 Pixeln, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen. Nach dem Zusatz richten Sie das Programm ein, um die Signalintensität im interessensnahen Steuerungsbereich zu messen.Wählen Sie das Rechteckwerkzeug aus, zeichnen Sie dann ein Quadrat von 20 x 20 Pixeln im Steuerelementbereich, und klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen. Schließlich wurde der Bereichsmanager für Interessensgebiete eingerichtet, um die Signalintensität im Hintergrundbereich von Interesse zu messen. Wählen Sie das Rechteckwerkzeug aus, zeichnen Sie ein Quadrat von 20 x 20 Pixeln im Hintergrundbereich, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen.Nachdem Sie die im ROI Manager zu analysierenden Regionen hinzugefügt haben, benennen Sie sie entsprechend in Bleach ROI, Control ROI und Background ROI um. Messen Sie die Signalintensität in jeder Region. Um dies zu erreichen, wählen Sie Bleach ROI, Control ROI und Background ROI aus, und gehen Sie dann zu Mehr, und wählen Sie Multi Measure aus.Fügen Sie die Ergebnisse in eine Kalkulationstabelle in Spalten mit den Bezeichnungen Bleach ROI, Control ROI und Background ROI ein. Beginnen Sie mit der Hintergrundkorrektur der Signalintensität im Bleich-ROI und dem Kontroll-ROI, indem Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Hintergrund-ROI von den Werten in der Spalte mit der Bezeichnung Bleach ROI und der Spalte mit der Bezeichnung Control ROI subtrahieren. Beschriften Sie diese neuen Spalten Corrected Bleach ROI und Corrected Control ROI.Als Nächstes normalisieren Sie das Signal im Bleich-ROI auf das Hintergrund-korrigierte Signal im Control ROI. Teilen Sie die Werte in der Spalte Mit der Bezeichnung Corrected Bleach ROI durch die Werte in der Spalte Mit der Bezeichnung Corrected Control ROI. Beschriften Sie diese neue Spalte, Normalized Corrected Bleach ROI.Normalisieren Sie dann das Signal in der Spalte Normalized Corrected Bleach ROI auf den Durchschnitt der fünf Vorbleichwerte im Bleich-ROI. Teilen Sie die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung Normalized Corrected Bleach ROI durch den Durchschnitt der fünf Vorbleichwerte im Bleich-ROI. Beschriften Sie diese neue Spalte, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.Öffnen Sie schließlich ein Programm für die Bildverarbeitung. Die Kurve passte zu den normalisierten und korrigierten Bleich-ROI-Daten, indem die postbleichen normalisierten korrigierten Bleich-ROI-Werte und die entsprechenden Zeitwerte kopiert wurden. Fügen Sie sie in das Fenster Kurvenanpassung ein, wählen Sie die exponentielle Erholung aus dem Dropdown-Menü Kurvenanpassung aus, und wählen Sie Anpassen aus.Hier ist ein typisches Video der Fluoreszenzerholung nach dem Photobleichen für RAW264.7-Zellen zu sehen, die mit LPS behandelt werden. Die Fluoreszenzerholung innerhalb der aggresome-ähnlichen induzierten Strukturregion von Interesse ist langsam. Dieses Experiment verwendet Photobleaching, um den Grad der Mobilität von p62 zu untersuchen.p62 Fluoreszenz in den aggresome-ähnlichen induzierten Strukturen, Vorbleichen und Postbleich, wird hier gezeigt. Wie in diesem Video beschrieben, kann die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit nachverfolgt werden. Nach Hintergrundkorrektur und Normalisierung kann die p62-Fluoreszenz berechnet werden, um den mobilen Bruch als 22% der unbeweglichen Fraktion als 78% zu beschreiben und die Halbzeit der Erholung innerhalb der aggresome-ähnlichen induzierten Strukturen, als 2,14 Minuten.Denken Sie daran, dass es besonders wichtig ist, die Erwerbsregion von Interesse richtig zu definieren, so dass sie eine ALIS von Interesse, eine Kontrollregion von Interesse und eine Hintergrundregion von Interesse umfasst. Nach diesem Verfahren können andere quantitative Fluoreszenzmikroskopie-Techniken angewendet werden, wie Fluoreszenzverlust bei Photobleichungen, FLIP und selektiver Photobleichung. Während FLIP den Grad der Kontinuität und Kommunikation zwischen subzellulären Kompartimenten misst, liefert selektive Photobleichung kinetische Informationen über den aktiven und passiven Transport von Proteinen in Organellen oder zwischen proteinreichen Bereichen.FRAP wurde ursprünglich entwickelt, um die laterale Bewegung von Proteinen in Zellmembranen zu quantifizieren. Anschließend wurde es verwendet, um die Proteinmobilität innerhalb und zwischen einer Vielzahl von subzellulären Kompartimenten zu quantifizieren, was den Forschern den Weg ebnete, Fragen in einer Vielzahl von Bereichen zu beantworten, einschließlich Zell- und Molekularbiologie, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften, Materialwissenschaft, fortgeschrittene Biomaterialien und Arzneimittelentdeckung.

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen

Abstract