Fluorescens återhämtning efter Fotoblekning av gula fluorescerande Protein taggade p62 i Aggresome-liknande inducerad strukturer

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein rörlighet i levande celler. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescens av upprepade imaging med låg intensitet laserljus. Därefter är de fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt nedsatt via kort exponering för högintensiva laserljuset. Information om protein rörlighet erhålls genom övervakning återvinning av fluorescens. Vi använde FRAP för att bestämma rörligheten för p62 i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina makrofager efter stimulering med lipopolysackarid (LPS). Eftersom många befintliga FRAP protokoll är antingen ofullständiga eller komplexa, var vårt mål att tillhandahålla ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Här beskriver vi RAW264.7 makrofag transfection med gula fluorescerande protein-p62 (YFP-p62), induktion av ALIS genom att utsätta celler till LP-skivor, och en stegvis metod för att samla in prebleach och postbleach FRAP bilder och dataanalys. Slutligen diskuterar vi viktiga faktorer att beakta när man genomför en FRAP experiment.