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Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.
Le goccioline del lipido (LDs) sono organelli bioattivi trovati all'interno del citosol delle più eucariotiche e alcune cellule procariotiche. LDs sono composte di lipidi neutri, racchiusi da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Lipidi epatici di LD, come ceramidi e proteine sono implicati in diverse patologie che causano steatosi epatica. Anche se i metodi precedenti sono stati stabiliti per l'isolamento di LD, richiedono una lunga preparazione dei reagenti e non sono progettati per l'isolamento di più compartimenti subcellulari. Abbiamo cercato di stabilire un nuovo protocollo per consentire l'isolamento di LDs, reticolo endoplasmico (ER) e lisosomi da un fegato del mouse.
Ulteriormente, tutti i reagenti utilizzati nel protocollo presentato qui sono commercialmente disponibili e richiedono una preparazione minima reagente senza sacrificare la purezza di LD. Qui presentiamo i dati che confrontano questo nuovo protocollo per un protocollo di gradiente di saccarosio standard, dimostrando la resa, la morfologia e la purezza paragonabile. Inoltre, possiamo isolare ER e lisosomi utilizzando lo stesso esempio, fornendo informazioni dettagliate sulla formazione e flusso intracellulare di lipidi e le proteine associate.
LDs sono organelli bioattivi trovati nel citosol delle cellule eucariotiche più e alcune cellule procariotiche1,2,3. Il nucleo di LD è composto da lipidi neutri come esteri del colesterolo e del trigliceride (TG). Inoltre contengono ceramidi, lipidi bioattivi coinvolti nella segnalazione cellulare vie4,5. LDs sono circondati da un monostrato di fosfolipidi e rivestito con proteine, tra cui la perilipina proteine perilipina 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,<....
Tutti gli esperimenti sono stati condotti su un banco di laboratorio con dispositivi di protezione individuale appropriati per livello di biosicurezza 1, compreso un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il disagio degli animali, e gli animali sono stati trattati con un'assistenza umana.
Abbiamo effettuato l'isolamento di LD con il kit ER su circa 30 topi e confrontato i risultati con quelli che seguono il protocollo di isolamento del saccarosio su circa 40 topi. I risultati segnalati sono tipici per entrambi i protocolli. Topi sono stati tenuti a digiuno durante la notte con libero accesso all'acqua, per aumentare il rendimento di LD. Isolamento di LD utilizzando un gradiente di saccarosio è stato eseguito in parallelo con il kit di ER protocollo di isolamento del LD. C.......
Biologia di LD epatica sempre più sta riconoscenda come regolatore critico della fisiologia epatocellulare in salute e malattia. Come buona fede organelli, LDs sono dinamici, interagire con altre strutture cellulari e contengono all'interno dei loro componenti bioattivi coinvolti nell'omeostasi del glucosio e del lipido. Il gradiente di saccarosio è usato ordinariamente per l'isolamento di LD e consente ai ricercatori di studiare la struttura della LD, ma richiede loro di fare numerosi buffer. Abbiamo dimostrato che l'.......
Dr. Carr riceve il sostegno alla ricerca da intercettare Pharmaceuticals.
Ringraziamo la famiglia Abramson Cancer Research Institute. Questo lavoro è supportato dalle seguenti concessioni: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medica facoltà Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (r.m.c.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH P30-DK050306 e suoi servizi di nucleo (patologia molecolare e di Imaging, biologia molecolare/Gene Expression Core e cella cultura Core) e il suo pilota programma di sussidi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Nati....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
ImageJ | Image Analysis Software | ||
Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
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