אנו מודים על ד ר ק'! סגיקוצ'י (מכון למחקר חלבון, באוניברסיטת אוסקה), ד ר מ' יאמאדה (מכון למחקר חלבון, באוניברסיטת אוסקה), ד ר טי Ikejima (סין-יפן מחקר מכון הרפואה, מדעי הרוקחות, מכללת Wuya חדשנות, שניאנג התרופות האוניברסיטה) ו ט הייאשי (סין-יפן מחקר מכון הרפואה, מדעי הרוקחות, מכללת Wuya של חדשנות, שניאנג התרופות האוניברסיטה) עבור הערות מועילות.

1. הכנת תקין תרבות בינוני
הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי.
<ol><li>הוסף 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין ואת של תוספת מוספים K-1 עד 500 מ"ל של סוג K110-II בינונית (K110) באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.</li>
</ol>2. הכנת fibril בצורת מסוג קולגן
הערה: לבצע הליכים עד שלב 2.6 בתנאים אספטי.
<ol><li>לשמור 10 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS (-)), יונים, קולגן, צלחת 96-ובכן תרבות ומים של צינור 2-mL ריק על קרח. הערה: אין להשתמש באותה הצלחת כדי להכין את fibril ואת טפסים שאינם סיבי.</li>
	<li>להוסיף 1.12 מיליליטר מים יונים שפופרת ריק mL 2 באמצעות פיפטה. להוסיף 200 µL של x 10 PBS (-) המים בצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה של יונים. בעדינות לנער את הצינור מספר פעמים.</li>
	<li>מוסיפים 0.66 מ"ל של קולגן הצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה. בעדינות ובמהירות ללחוץ את הצינור מספר פעמים. הערה: יש להימנע בועות-צורה הפתרון ככל האפשר. להכין פתרון קולגן מיד לפני השימוש.</li>
	<li>יוצקים µL 100 של הפתרון קולגן מהשלב 2.3 לבאר כל צלחת 96-ובכן תרבות. בעדינות לרעוד לצלחת תרבות שמאלית תנועה ימינה. הערה: לכסות את המשטח כולו מן הבארות עם הפתרון קולגן. אם הפתרון אינו מכסה את כל פני השטח, להתפשט הפתרון באמצעות טיפ פיפטה. למנוע היווצרות בועה בפתרון ככל האפשר.</li>
	<li>למקם את הצלחת תרבות חממה2 CO, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' הסימון gelation של קולגן ולהעביר לצלחת תרבות אל ספסל נקי. הערה: אשר gelation על-ידי הטיית לצלחת תרבות.</li>
	<li>שופכים בעדינות µL 150 של K110 על ג'לים באמצעות פיפטה לאורך הקיר של הבאר, מקום התרבות צלחת בתוך חממה2 CO דגירה ב 37 ° C עבור ה 1 ההעברה לצלחת תרבות ספסל נקי. לפני תרבית תאים, בעדינות למחוק את K110 באמצעות פיפטה של. הערה: כדי להגן על ג'לים, קצה פיפטה צריך לגעת בקיר הבאר.</li>
</ol>3. הכנת בצורת סיבית מסוג קולגן
הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי.
<ol><li>להוסיף 4 µL של קולגן 1.2 מ של 1 מ מ חומצת מימן כלורי (HCl) צינור 1.5 מ"ל ומערבבים בעדינות בעזרת פיפטה. הערה: להכין קולגן מיד לפני השימוש. לשמור קולגן HCl מקורר עד למועד השימוש.</li>
	<li>שופכים µL 100 של קולגן לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן תרבות באמצעות פיפטה. בעדינות לרעוד לצלחת תרבות שמאלית נכון תנועה, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח. הערה: ודא כי השטח כולו מן הבארות מכוסה פתרון.</li>
	<li>לאחר הדגירה, לבטל את הפתרון קולגן, לשטוף את הבארות עם PBS (-) פעמיים באמצעות פיפטה.</li>
	<li>יוצקים µL 150 של 1% שור אלבומין/PBS (-) (1% BSA) לבאר, צלחת תרבות 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לפני תרבית תאים, למחוק את 1% BSA. הערה: ודא כי השטח כולו מן הבארות מכוסה פתרון.</li>
</ol>4. התרבות של תאים FEPE1L-8
הערה: ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי.
<ol><li>לשמור על תאים FEPE1L-8, K110 100 מ מ תרבות מנה בחממה2 CO ועל מודגרות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, כדי confluency למחצה.</li>
	<li>להכין K110 טריפסין, מעכבי טריפסין באמבט מים בטמפרטורה 37 º c</li>
	<li>בזהירות להסיר את המדיום של המנה תרבות, להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.05% באמצעות פיפטה של, למקם את המנה חממה2 CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר דגירה, לבדוק ניתוק התא מפני השטח של המנה תרבות באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהגדלה x 10. הערה: המורפולוגיה של תאי מנותקת הופך עגול. אם תפיץ התאים, דגירה, לתקופה נוספת של 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של מעכבי טריפסין ולאסוף בתאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל באמצעות פיפטה מנותקת. Centrifuge התאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל ב g x 200 במשך 5 דקות.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה של K110 באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. לספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהגדלה x 10 והכן תא ריכוז-5.0 x 104 תאים למ"ל על ידי דילול המתאים עם K110.</li>
	<li>בעדינות זרע 0.1 מ"ל של K110 עם תאים בבאר בכל צלחת תרבות באמצעות פיפטה לאורך הקיר של הבאר. הכנס את הצלחת תרבות חממה2 CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך הזמן המצוין (h 2, 1 יום, 3 ימים). הערה: כדי להגן על ג'לים, קצה פיפטה צריך לגעת בקיר הבאר.</li>
</ol>5. אומדן של מספר התאים קיימא
<ol><li>דגירה K110 באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מיקס 130 µL של tetrazolium מלח, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, מונוסודיום מלח (wst, מרץ-8) ו- 1.3 מ של K110 צינור 2-mL באמצעות פיפטה.</li>
	<li>להעביר לצלחת תרבות ספסל נקי ולמחוק בעדינות את K110 באמצעות פיפטה של. בעדינות לשטוף תאים שאינם מחסידי K110 באמצעות פיפטה</li>
	<li>הוסף µL 110 של K110 מעורבב עם wst, מרץ-8 בכל טוב באמצעות פיפטה של, למקם את הצלחת תרבות חממה2 CO, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
	<li>להעביר לצלחת תרבות ספסל נקי, לאסוף 100 µL של המדיום ממוזגים מכל קידוח, והעברתו לבאר צלחת 96-ובכן תרבות אחרת. למדוד את ספיגת באורך-גל של 450 nm (OD450) באמצעות microplate לקורא להעריך מספר התאים קיימא.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior.">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li><li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates.">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li><li>Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+and+its+components+in+culture.">Use of extracellular matrix and its components in culture.</a> Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).</li><li>Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+distribution+of+collagen+binding+sites+on+fibroblasts+cultured+within+collagen+gels.">Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels.</a> Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).</li><li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation:+Acid-soluble,+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen.">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li><li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5/10/11+deposition+and+Akt+signaling.">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li><li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils.">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li><li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+proliferation,+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K/AKT+signaling+pathway.">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li><li>Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+regulation+of+integrin&#8208;mediated+mechanotransduction+during+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Matrix stiffness regulation of integrin&#8208;mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).</li><li>Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+basement+membrane:+The+foundation+of+epidermal+integrity-+BM+functions+and+diverse+roles+of+binding+molecules+nidogen+and+perlecan.">Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan.</a> BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).</li><li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells,+HaCaT+and+FEPE1L-8.">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li><li>Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+primary+human+epithelial+cells+by+cloned+cervical+carcinoma+DNA+containing+human+papillomavirus+type+16+E6/E7+open+reading+frames.">Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames.</a> Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).</li><li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts.">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li><li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen.">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li><li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels.">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li><li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment.">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922 (2014).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases.">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li><li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH.">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li><li>Hattori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+-Type+IV+collagen+hybrid+gel.">Type I -Type IV collagen hybrid gel.</a> European patent. , (2015).</li><li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1.">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-&#954;B-mediated+proliferation+and+migration.">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-&#954;B-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כמה רכיבים ECM, כולל מסוג קולגן, טופס תלת ממדי מבני ויוו1. Culturing על כזה תלת ממדי, ג'ל המצע מספק יותר מצבים פיזיולוגיים vitr בo מאשר על משטח דו מימדי פלסטיק1,2,3,4. פרוטוקולים רבים בנוגע לשיטת תרבות ג'ל דווחו, כגון שימוש מסוג קולגן1,2,3,4,6,7, 11, הסוג הרביעי קולגן14,15Matrigel16. סוג הקולגן הוא חומר מוגדרים היטב והשימוש בהם נפוץ בשל שפע קלות הטיפול. התכונות של סוג מטוהרים אני קולגן תלוי בבעלי חיים מינים, גיל, טיהור שיטות5,17. סוג הקולגן יטוהר באמצעות חומצה אצטית ו/או פרוטאזות, כגון פפסין, פפאין ו proctase5,17. חומצה-מסיסים קולגן שומרת על telopeptides אמינו קולגן פרוטאז מסיסים הם cleaved אמינו-telopeptides5,17. אורך שמורות אמינו-telopeptides תלוי בסוג של פרוטאזות, ואת הנוכחות של telopeptides משפיע על מורפולוגיה fibril ג'ל חוזק5,17. צמיגות של הסיבים מסיסים חומצה קולגן הוא גדול יותר מזה של collagens שטופלו פרוטאז17. במחקר זה, השתמשנו חומצה-מסיסים שור מסוג קולגן. קולגן פפסין-solubilized יכול לשמש גם בפרוטוקול תרבות זו ג'ל '; אולם, הכוח ג'ל הוא חלש יותר17. הבדלים אלה חומרים יכולים לגרום הבדלים התנהגותיים התא, אך הם כיום אינם מובנים היטב.
פרוטוקול תרבות ג'ל המתוארים במחקר זה היא פשוטה מאוד. בשינויים רבים בשיטה זו דווחו. שינוי אפשרי אחד לתרבות של keratinocytes היא לחקות את קרום המרתף. ג'לים קולגן סוג IV ייתכן שעדיף לשמור על מבנה דמוי קרום המרתף המצע חוץ גופית15,18. עם זאת, תקופת הדגירה ארוכה נדרש על פי סוג IV קולגן ג'לים14,15,18. במקום זאת, ערבוב קולגן סוג IV עם מסוג קולגן ג'לים יכול לייצר תרבות הרומן מצעים (מסוג I / סוג IV קולגן היברידית ג'לים)19. ג'לים היברידית אלה הן קל לטפל, דרוש זמן קצר עבור gelation, תשואה יותר תנאים כמו קרום המרתף keratinocytes. על סוג / סוג IV קולגן היברידית ג'ל, keratinocytes לשרוד, יוצרים מושבות, זירוז התמיינות סופנית19. שיטה זו היברידית כולל מיכלים.
באמצעות התרבות בג'ל מסוג קולגן משפיע על תאים סרטניים. של הטופס fibril מסוג קולגן, Akt ההפעלה ואת הצמיחה של קאקו-2 תאים (קו תא קולון סרטן) הם מודחקים7. בנוסף, הצמיחה של תאים מלנומה אנושיים (M24met) על גבי טופס fibril נעצר בקו ה G1/S במחסום20. יתר על כן, רמות גבוהות במידה ניכרת של מינים חמצן תגובתי הם נצפו preadipocytes מאתר 3T3-L1 תרבותי בטופס fibril. יתר על כן, התפשטות תאים והעברה הם גירוי בכיוונים מנוגדים על ידי אי-סיבית, צורות fibril מסוג קולגן21.

רקמות החיבור בין המרכיבים תלת ממדי חלבון meshwork של הרכב הטרוגנית, מורכב בעיקר סוג אני קולגן הסיבים1. קולגן הסיבים לשחק תפקיד מפתח בדומה לפיגום עבור תאים1,2,3 , אינטראקציה עם חלבונים אחרים מטריצה חוץ-תאית (ECM)3. במבחנה, שונה צורות מסוג קולגן יכול לשמש בשם דיאלקטריים תרבית תאים בהתאם הטיפול בשיטה1,2,3,4. בתנאים חומציים, מסוג קולגן שומרת על טופס סיבית5. ציפוי המשטח של תרבות מנות עם הטופס שאינם סיבי מקדמת תא אדהזיה והתפשטות6,7. -פיזיולוגיים pH, טמפרטורה, סוג הקולגן מולקולות להרכיב מחדש לתוך הסיבים בצורת ג'ל אחזקת המבנה התלת-ממדי1,2,3,4, 5,-6,-7,-8. ישנם כמה חשוב הבדלים בין fibril לבין צורות סיבית מסוג אני קולגן, כולל מטריקס נוקשות ועל היעילות של שחזור של רכיבי ה-ECM על ידי התאים במהלך תרבות1. מטריצת קשיחות הוא אחד הגורמים רגולטוריות הכי נחקרות תא תרבות1, 9. עם זאת, הגומלין המורכבים בין סובסטרטים התאים נשארים הבהרה. כדי לבחון את מורכבות האינטראקציות בין תאים לבין גורמים סביבתיים, מערכת פשוטה היא שימושית. השוואה של ההתנהגות הסלולר על שתי צורות שונות של קולגן עשוי לעזור כדי לפשט את השפעת גורמים סביבתיים. בהתאם, מטרת השימוש בהם, צורות שונות מסוג קולגן באופן סלקטיבי ניתן. בדרך כלל, keratinocytes נמצאים בקשר עם קרום המרתף אבל לא עם מסוג קולגן. עם זאת, במהלך ריפוי הפצע, keratinocytes לעבור רקמת חיבור עורי, להתרבות, לרפא את הפצע.10.
לאחרונה, אנחנו הראו כי ריכוז סידן חוץ-תאית חשוב עבור הפצת תקין שורת תאים באמצעות מערכת התרבות של הטופס fibril מסוג קולגן מחקה את רקמת חיבור עורי11. כאשר הקו תא תקין FEPE1L-8 היה תרבותי של הטופס fibril מסוג קולגן, צורת התאים היה עגול, proliferations שלהם היו עצר של ריכוז סידן חוץ-תאית μM 3011. כאשר ריכוז הסידן הוגדל ל 1.8 מ"מ, גדילת התאים היה התאושש11. התאים גדל תחת שני ריכוזי סידן (30 μM ו 1.8 מ"מ) כאשר תרבותי טופס שאינם סיבי11, ואילו הם היו רגישים יותר ריכוז הסידן אקסוגני כאשר תרבותי בטופס fibril. FEPE1L-8 נוצר באמצעות תרביות תאים עם וירוס הפפילומה סוג 16 הפיכת הגנים E6, E7 מן האנושי קרצינומה בצוואר הרחם, שאינם tumorigenic, לעכב את התפשטות ללא הגבלה עם פוטנציאל כמו נורמלי keratinocytes מוגבלת בידול 12,13. FEPE1L-8 תאים יכול להישמר באמצעות סוגים מסוימים של מדיום מסוים תקין, כולל סוג K110-II עם תוספת מוספים K-1 (K110)6. כאן, אנו מתארים פרוטוקול תרבות של הקו תא אנושי תקין-שאינו-סיבית, צורות fibril מסוג קולגן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1096px;" width="1094">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Albumin, from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">1 % BSA&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td>Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td>
			<td>347-07621</td>
			<td>tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H&#160;tetrazolium, monosodium salt (WST-8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type I (Acid soluble collgen)</td>
			<td>Nippi Inc.</td>
			<td>ASC-1-100-20</td>
			<td>from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate</td>
			<td>ADVANTEC Co., LTD.</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human keratinocyte line cell&#160; FEPE1L-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">K-1</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 &#181;g of h-EGF and 5 mg of heparin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K110 Type-II medium</td>
			<td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td>28204</td>
			<td>keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">PBS (-)&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">10x PBS (-)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>1670049</td>
			<td>10000 units/mL of penisillin G and 10,000&#956;g/mL of streptmycin sulfate in physiological saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368-10 pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">0.05 % trypsin&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">T4799</td>
			<td>Dissolve 0.25 g of&#160; trypsin and&#160; 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-)&#160; and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td>Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates

מסוג קולגן, שימושי כמו מצע תא תרבות, קיים בשתי צורות: הטופס דו מימדי, שאינם סיבי תלת ממדי, טופס fibril. שתי הצורות ניתן להכין עם אותו סוג הקולגן. באופן כללי, הטופס סיבית מקדם הידבקות תאים והתפשטות. הטופס fibril (ג'ל) מספק יותר מצבים פיזיולוגיים סוגים רבים של תאים; לכן, תרבות ג'ל הוא שימושי עבור בחינת התנהגויות פיזיולוגיים של תאים, כגון יעילות התרופה.
החוקרים יכולים לבחור את הטופס המתאים בהתאם לצורך השימוש שלה. לדוגמה, במקרה של keratinocytes, שימש בג'ל תרבות כמו פצע ריפוי מודל. FEPE1L-8, קו תא תקין תרבותי בטופס סיבית מסוג אני קולגן, לקדם את התא אדהזיה. ראוי לציין, התפשטות תקין הוא איטי בטופס fibril מאשר הטופס סיבית. פרוטוקולים עבור הכנת מסוג קולגן כי תרבית תאים פשוטים, יש יישומים רחב בהתאם לצרכים ניסיוני.

ייצוג סכמטי של הטיפול של המשטחים של מנות תרבות באמצעות שימוש מסוג קולגן מתואר באיור1. תא מורפולוגיות נצפתה בטפסים שאינם-סיביים וקשים fibril מוצגים הפאנלים מצד שמאל ימין של איור 2, בהתאמה. FEPE1L-8 תאים היו תרבותי עבור 2 h (לוחות העליון) ו- 3 ימים (לוחות נמוכה יותר). ב- h 2 הראשונית של culturing, התאים דבקה ולהתפשט על שתי צורות של קולגן (איור 2, לוחות העליון). שלושה ימים לאחר זריעה, תאים בטופס שאינם סיבי המשיך להתפשט וסלולרי מספרם גדל (איור 2, החלונית השמאלית התחתונה). לעומת זאת, התאים בטופס fibril הראו מוגבלת מפיצים (איור 2, החלונית התחתונה נכון). FEPE1L-8 התאים המשיך להתרבות בטופס סיבית מסוג אני קולגן (איור 3, קו שחור מלא, סגור עיגולים שחורים), על המנה לא מטופלת משטחים (איור 3, מנוקד קו אפור, עיגולים אפורים סגור). לעומת זאת, תאי לא להתרבות בטופס fibril (איור 3, קו מנוקד, עיגולים פתוח). איור 2 ו- 3 איור שונו מ Fujisaki ואח '11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg"> איור 1 : ייצוגים סכמטי של תרבות מאכל משטחים שטופלו סוג אני קולגן. בתנאים חומציים, מסוג קולגן הספוחה הם מולקולות על פני השטח של תבשיל בצורה הלא-סיבית (החלונית הימנית). בתנאים ניטרליים ב 37 מעלות צלזיוס, מסוג קולגן מולקולות הן לתוך הסיבים ואת הספוחה על פני השטח של מנות בצורת ג'ל (לוח נכון). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg"> איור 2 : המורפולוגיה של תאי FEPE1L-8- תאים FEPE1L-8 K110 היו תרבותי באמצעות הטופס סיבית (10 µg/mL; לוחות שמאלה) או צורה fibril (1 מ"ג/מ"ל; לוחות הנכון) של סוג הקולגן כבר שעתיים (לוחות העליונה) או 3 ימים (לוחות נמוכה יותר). לבן מציינות 100 מיקרומטר. איור 2 שונה מ- Fujisaki et al. איור 1E – H11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg"> איור 3 : התפשטות תא FEPE1L. מספר התאים קיימא הוערך על גבי טופס שאינו סיביים (קו שחור מלא, מלא עיגולים שחור) או על fibril הטופס (קו מנוקד, עיגול פתוח) של מסוג קולגן, או תבשיל שאינו מטופל משטחים (קו מנוקד אפור, אפור מלא עיגולים) עבור 2 h, יום 1, ו- 3 ימים. הניסויים בוצעו ב triplicates ואת הערכים מוצגים אמצעי + SD. איור זה השתנה מ Fujisaki et al. איור 1J11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates at JoVE.com

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור הכנת בשתי צורות שונות של תרבות סובסטרטים ניצול מסוג קולגן. בהתאם דרך הטיפול קולגן, קולגן מולקולות לשמור על צורה דו-ממדית, הלא-סיבית או להרכיב מחדש לצורה תלת ממדי, fibril. התפשטות תאים על סוג הקולגן מושפע באופן משמעותי היווצרות fibril.

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

וידאו זה מראה כיצד להכין שני סוגים שונים של מצעים תרבות התא באמצעות קולגן מסוג I ושיטת תרבות דו מימדית ותלת מימדית. שיטת התרבות התלת מימדית נחשבת לסביבה הביולוגית, ומדגימה כיצד להכין בקלות מצע תרבות תלת מימדי שימושי למחקרים. בסוגי תאים רבים, למרות השימוש באותו קולגן, התנהגות התא משתנה במידה ניכרת בין מצעים דו מימדיים ותלת מימדיים.באמצעות מצע תרבות תלת מימדי, ניתן לבחון בקלות התנהגות תאים הדומה יותר לאלה של אורגניזמים חיים. שיטה זו היא פשוטה מאוד ודורשת ריג'נט מיוחד מינימלי. הדגמה חזותית היא קריטית, כי בעוד שאנחנו רוצים להוכיח כי שיטה זו היא ניסתה בקלות, ג'ל תלת מימדי הוא שביר, וטיפול בו כראוי חשוב מאוד.כדי להתחיל, להכין את מדיום התרבות המתאים. כדי להתחיל להכין את הקולגן, מניחים 10x PBS, מים deionized, קולגן, צלחת תרבות 96 באר, צינור ריק שני מיליליטר על קרח. באמצעות פיפטה, להוסיף 1.12 מיליליטר של מים deionized לצינור ריק שני מיליליטר.הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 10x PBS למים המיומנים, ונערו בעדינות את הצינור מספר פעמים. מיד לפני השימוש, להוסיף 0.66 מיליליטר של קולגן לצינור שני מיליליטר. בעדינות ובמהירות לנער את הצינור מספר פעמים.יוצקים 100 מיקרוליטרים של פתרון קולגן זה לתוך כל באר של צלחת תרבות 96 היטב, הקפד לכסות את כל פני השטח של בארות. לנער בעדינות את הצלחת בתנועה משמאל לימין. הדגירה את צלחת התרבות באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.ואז להטות את הצלחת כדי לאשר את gelation של הקולגן, ולהזיז את צלחת התרבות לספסל נקי. יוצקים בעדינות 150 מיקרוליטרים של K110 על הג'לים על ידי צינורות לאורך קיר הבירה. אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, להעביר את צלחת התרבות לספסל נקי. מיד לפני תרבות התא, השתמש פיפטה כדי להשליך בעדינות את K110. ראשית להשתמש פיפטה להוסיף ארבעה microliters של קולגן ל 1.2 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מילימולרית אחת בצינור 1.5 מיליליטר, ומערבבים בעדינות.יוצקים 100 מיקרוליטרים של תערובת קולגן זו לתוך כל באר של צלחת תרבות חדשה של 96 באר. מנערים בעדינות את הצלחת בתנועה משמאל לימין ומטגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, להשליך את פתרון הקולגן.באמצעות פיפטה, לשטוף כל גם עם PBS. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של 1%BSA ו-PBS לכל באר של צלחת התרבות, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לפני תרבות התאים, בטל את הפתרון של 1%BSA.כדי להתחיל, להכין את התאים FEPE1L-8 ואת K110, טריפסין, מעכב טריפסין כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. בזהירות להסיר את המדיום מן צלחת התרבות, ולהשתמש פיפטה להוסיף שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין. מניחים את המנה בחזרה לתוך אינקובטור פחמן דו חמצני, ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן השתמש במיקרוסקופיה ניגודית פאזה בהגדלה של פי 10 כדי לבדוק אם יש ניתוק תאים מפני השטח של צלחת התרבות. מוסיפים שלושה מיליליטר של מעכבי טריפסין, ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את התאים מנותקים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולתלות את גלולה ב 10 מיליליטר של K110. השתמש במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10 כדי לספור את התאים, ודלל את התאים עם K110 לצפיפות תאים של 50,000 תאים למיליליטר. בעדינות זרע 0.1 מיליליטר של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת התרבות על ידי צינורות לאורך הקיר של הבאר.אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים. ראשית לערבב 130 microliters של מלח טטרזוליום WST-8 עם 1.3 מיליליטר של K110 שחומם מראש בצינור שני מיליליטר. מעבירים את צלחת התרבות לספסל נקי, ולהשתמש פיפטה כדי להשליך בעדינות את K110 מן הבארים.יש לשטוף בעדינות תאים לא עקביים עם K110. לאחר מכן הוסיפו 110 מיקרוליטרים של K110 מעורבבים עם WST-8 לכל באר. אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.לאחר מכן, להעביר את צלחת התרבות לספסל נקי. לאסוף 100 microliters של המדיום מותנה מכל באר, ולהעביר אותו לתוך הבארים של צלחת תרבות חדשה 96 באר. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר, ולה מעריך את מספר תאים קיימא.מורפולוגיה התא נצפתה על צורות לא סיביים פיבריל מוצגים כאן. ב שעתיים הראשונות של culturing, התאים לדבוק ולהפיץ על שתי צורות של קולגן. שלושה ימים לאחר הזריעה, תאים בצורה שאינה סיבית ממשיכים להתפשט, ומספרי התאים גדלים, בעוד התאים בטופס הפיבריל מראים התפשטות מוגבלת.תאי FEPE1L-8 ממשיכים להתרבות על הצורה הלא סיבית של קולגן מסוג I ועל משטחי המנה הלא מטופלים. לעומת זאת, התאים אינם מתרבים על צורת הפיבריל. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי ג'ל תלת מימדי הוא שביר מאוד.יש להיזהר כדי להבטיח כי הפתרון או טיפים לא באים במגע ישיר עם ג'לים. ניתן לשנות שיטה זו בדרכים רבות. לדוגמה, כדי לערבב את רכיבי הממברנה של הדגימה, ניתן ליצור מצע לתרבות תאים המחקה קרום מרתף.במקרים רבים, הפונקציות של מטריצה חוץ-תאית בגופים חיים אינן ידועות. לתאי תרבות בתרבות התלת מימדית, ניתן לבחון את הפונקציה של רכיב מטריצה חוץ-תאית הדומה יותר לגוף החי. על ידי יישום טכניקות תלת מימדיות של תרבות ג'ל, ניתן לבדוק ביעילות את ריכוז התרופות בתאים.פרוטוקול זה, המבוסס על מטרתו של האדם, יכול לשמש לפיתוח מצעי תרבות תלת מימדיים מורכבים על ידי ערבוב רכיבי EGM אחרים או גורמי גדילה במהלך gelations.

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Abstract