Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Özet

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Özet

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, onlarca nanometre uzamsal ve milisaniye zamansal çözünürlükle canlı hücrelerdeki tek tek moleküllerin pozisyonunu ve hareketlerini inceler. Bu yetenekler, fizyolojik olarak ilgili ortamlarda moleküler düzeydebiyolojik fonksiyonları incelemek için tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ideal hale getirmektedir. Burada, ilgi çekici bir proteinin sergileneebileceği farklı difüzif durumları ayıklamak için tek moleküllü izleme verilerinin hem elde edilmesi hem de işlenmesi/analizi için entegre bir protokol gösteriyoruz. Bu bilgiler canlı hücrelerdeki moleküler karmaşık oluşumu ölçmek için kullanılabilir. Kamera tabanlı 3D tek moleküllü yerelleştirme deneyinin ayrıntılı bir açıklamasını ve tek tek moleküllerin yörüngelerini sağlayan sonraki veri işleme adımlarını salıyoruz. Bu yörüngeler daha sonra floresan etiketli moleküllerin yaygın diffusive durumları ve bu devletlerin göreceli bolluk ayıklamak için sayısal bir analiz çerçevesi kullanılarak analiz edilir. Analiz çerçevesi, rasgele hücre geometrisi ile uzaysal olarak sınırlı olan hücre içi Browndifüzyon yörüngelerinin stokakstik simülasyonlarına dayanmaktadır. Simüle edilen yörüngelere dayanarak, ham tek moleküllü görüntüler deneysel görüntülerle aynı şekilde üretilir ve analiz edilir. Bu şekilde, deneysel olarak kalibre edilmesi zor olan deneysel hassasiyet ve doğruluk sınırlamaları, analiz iş akışına açıkça dahil edilir. Yaygın difüzyon katsayısı ve yaygın diffüzif durumların göreli popülasyon fraksiyonları, simüle edilmiş dağılımların doğrusal kombinasyonları kullanılarak deneysel değerlerin dağılımları uygun hale alınarak belirlenir. Bakteriyel bir patojenin sitosolunda homo- ve hetero-oligomerik kompleksler oluşturarak farklı diffusive durumları sergileyen bir proteinin diffüzif durumlarını çözerek protokolümüzün yararını gösteriyoruz.

Giriş

Biyomoleküllerin diffüzif davranışlarının incelenmesi biyolojik işlevlerihakkında bilgi sağlar. Floresan mikroskobu tabanlı teknikler kendi doğal hücre ortamında biyomolekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir. Fotobeyazrlama (FRAP) ve floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) 1 sonrası floresan iyileşme¹ topluluk ortalama difüzif davranışlar sağlar. Tersine, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük^2,3,4ile bireysel floresan etiketli moleküllerin gözlem sağlar. İlgi çekici bir protein farklı diffüzi....

Protokol

1. Çift sarlak noktası-yayma fonksiyonu kalibrasyonu

NOT: Bu ve aşağıdaki bölümlerde açıklanan görüntüler, Rocha ve ark.^23'teaçıklandığı gibi, özel olarak oluşturulmuş ters floresan mikroskobu kullanılarak elde edilir. Aynı prosedür tek moleküllü lokalizasyon ve izleme mikroskobu 2^,3,4için tasarlanmış farklı mikroskop uygulamaları için geçerlidir. Bu makalede açıklanan görüntü toplama ve veri işleme için tüm yazılımlar mevcuttur (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

1. Mik....

Sonuçlar

Burada açıklanan deneysel koşullar altında (20.000 kare, yörünge uzunluğu en az 4 lokalizasyon) ve floresan etiketli füzyon proteinlerinin ifade düzeylerine bağlı olarak, yaklaşık 200-3.000 lokalizasyon 10-150 verim yörüngeler hücre başına oluşturulabilir (Şekil 2a,b). Belirgin difüzyon katsayıları iyi örneklenmiş bir dağılım üretmek için çok sayıda yörünge gereklidir. Burada toplanan FOV boyutu ~ 55 x 55 μm.......

Tartışmalar

Sunulan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için kritik bir faktör, tek moleküllü sinyallerin birbirinden iyi ayrılmasını sağlamaktır (yani, uzayda ve zamanda seyrek olmaları gerekir(Ek Mov. 1)). Bir hücrede aynı anda birden fazla floresan molekül varsa, lokalizasyon başka moleküllerin yörüngesine yanlış atanabilir. Bu bağlantı sorunu³⁰olarak adlandırılır. Bağlanma problemini önlemek için protein ekspresyonu düzeyleri ve uyarma lazer yoğu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.