עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין 81402582, הקרן המדע הטבעי של שנגחאי 12DZ2295100, 14YF1400600 ו 18ZR1404500

כל ההליכים בעלי חיים אושרו ובעקבות ההנחיות של ועדת האתיקה בעלי חיים באוניברסיטת Fudan וכל הדגימות סרטן הלבלב התקבלו מאוניברסיטת Fudan שנגחאי מרכז הסרטן. אישור אתי התקבל מוועדת האתיקה של FUSCC, והסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל מטופל.
1. הכנת ציוד להזרקות
<ol><li>
. מכין את לוחית ההזרקה<...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

הן PDX ו-CDX מודלים הם פלטפורמות חיוניות בתחום של ביולוגיה של הגידול22, ואת הצעד הקריטי של השתלת בין זנים מוצלחת היא לשפר את ההישרדות של xenograft.  לאחרונה, מחקרים מסוימים הראו כי ביטוי חולף של BCL2L1 (BCL-XL) או BCL2 עשוי לשפר באופן משמעותי את הכדאיות של תאים גזע האדם מתחלקים במ?...

האונקולוגיה בדיוק שואפת למצוא את האסטרטגיות הטיפוליות המועילה ביותר עבור המטופל היחיד1. כיום, מודלים רבים פרה-קליניים כגון בתרבות הראשית מחוץ לעולם, בתרבות הארגונית מחוץ לחוק2, והמטופל נגזר xenografts (pdx) בעכברים לפני או אחרי תרבות ארגונית מוצעים לאבחון ולמסך/להעריך את הפוטנציאל אפשרויות טיפוליות3. Pdx מודל שנוצר על ידי ההזרקה של התאים האנושיים הראשוניים לתוך עכברים החיסונית פרוצים, הוא אחד הכלים המבטיחים ביותר עבור הקרנת תרופות אישית באונקולוגיה קלינית3,4. שלא כמו קו התאים התרבותי בתחום החוץ, מודלים PDX בדרך כלל לשמר את היושרה ואת טרוגניות של סביבת הגידול vivo, טוב יותר לחקות את המאפיינים מגוון וייחודית של חולי גידולים שונים, ולכן, עשוי לנבא את תוצאה רפואית פוטנציאלית של חולים4. עם זאת, הדור של מודלים pdx בעכברים דורש באיכות גבוהה דגימות המטופל וחודשים של זמן לאסוף תאים מספיקים ומודלים עבור ניסויים קבוצה מרובת, ואת היצירות הסלולר/גנטי של השתל מבע להיסחף מאלה של המקורי ביופסיהשל המטופלת שיעור ההצלחה של הקמת עכברים מודל PDX הוא גם נמוך, מה שמקשה להיות מיושם באופן נרחב בפרקטיקה הקלינית. עבור המטופלים שנשאו במהירות סרטן התקדמה כמו סרטן הלבלב, הם לא יכולים לקבל מידע חשוב מניסויים PDX בזמן.
בשנים האחרונות, דג זברה דווחו להיות מארחים פוטנציאליים עבור לא רק cdx (תא נגזר הגידול xenograft) מודלים, אבל גם pdx מודלים5,6,7,8,9 , 10. כבעל חיים במודל בעלי חוליות, הנמלים בעלי דמיון מספיק עם יונקים בגנטיקה ופיזיולוגיה, עם שני יתרונות משמעותיים: שקיפות קטן בגודל11. זברפיש הוא גם מאוד פוריות, ומאות הזחלים המאוזיים יכולים להיות מתקבלים תוך כמה ימים מזוג אחד של מבוגרים12. מספר מחקרים המועסקים דג זברה כדי ליצור הן מודלים הטרנסגניים ו מבע מחלות סרטן13,14. בהשוואה לעכברים xenografts, דג זברה מאפשר מעקב ברזולוציה תא בודד. כמות מסוימת של רקמות האדם הוא מסוגל לייצר מאות דג זברה מודלים pdx (zpdxs), בעוד יכול להיות מספיק רק כדי ליצור כמה עכברים pdx מודלים15,16. חוץ מזה, הזחלים דג זברה ב 2-5 dpf כבר לפתח מערכות הדם המלא איברים מטבוליים כגון כבד וכליות, אבל לא את המערכת החיסונית17, בעוד שק החלמון הנותרים הוא בינונית 3d טבעי, אידיאלי עבור הקרנת סמים, סמים בדיקות התנגדות ותצפיות הגירה לגידול6,18,19,20,21.
עם ניסיון אולטימטיבי להשתמש zPDX כפלטפורמת הקרנה/בדיקה לשימוש קליני, כאן, אנו מתארים הצעה ממוטבת עבור מודל zPDX של סרטן הלבלב, אשר מאפשר את הערכת הסמים vivo המועמד תוך זמן קצר באמצעות פחות תאים בעלויות נמוכות. לעומת ההפניות הקודמות על zpdx6,9,10, הצגנו מספר אופטימיזציות כדי להפוך את המערכת יותר ריאלי ואמין עבור אבחון מותאם אישית קליני: 1) טרום מיון תא אחר קבוצות ברקמות הגידול הראשיות וייצוב תאים ראשוניים לשבוע אחד לפני ניסויים נוספים; 2) מתייג את התאים האנושיים ומשפר את הכדאיות התאית ב-מבע באמצעות שינוי גנטי מבוסס-וירוס; 3) מיטוב מצבם של תרבות הדגים בתוספי התזונה (גלוקוז ו גלוטמין) ובטמפרטורה; 4) מכמת את תגובות הסמים של סוגי תאים שונים באופן השוואתי. כמו כן עשינו שינויים בפתרון ההזרקה על ידי הוספת מספר חומרים משלימים. בסך הכל, שיפורים אלה מספקים את האפשרות לייצר במהירות יותר מטופל כמו מבע במארחים דג זברה שיכול לשמש ככלי אמין כדי להעריך את התגובה של תרופות המועמדים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

החולה-נגזר הגידול מבע (pdx) ו-cell נגזר הגידול מבע (cdx) הם שיטות חשובות להערכת טרום קלינית, תרופות הדרכה ומחקרים סרטן בסיסיים. דורות של מודלים PDX בעכברים מארחים מסורתיים הם לגזול זמן ועובד רק עבור חלק קטן של דגימות. לאחרונה, דג זברה pdx (zpdx) התפתחה כמערכת מארח ייחודי, עם המאפיינים של בקנה מידה קטן ויעילות גבוהה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה אופטימיזציה ליצירת מודל כפול בעלי התווית של זריחה כפולה להערכת כימותרפיה השוואתית בדגמי zPDX. תאים סרטניים ופיברותקיעות היו מועשר מרקמת סרטן הלבלב שנקטפו או קפוא בתנאי תרבות שונים. שתי קבוצות התא היו מסומנים על ידי וירוס המבטא ירוק או אדום חלבונים פלורסנט, כמו גם BCL2L1גן אנטי אפופטוזיס. התאים המוזרקים היו מעורבים מראש ומוזרק לתוך 2 הזחל בדגים שהיו לאחר מכן ב E3 בינוני שונה ב 32 ° c. מודלים מבע טופלו על ידי תרופות כימותרפיה ו/או BCL2L1 מעכב, ואת היכולות של תאי הגידול הן והפיברוביטים נחקרו בו זמנית. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להפיק במהירות כמות גדולה של מודלים zPDX עם מיקרוסביבה גידול הטרוגנית ומספק חלון התבוננות ארוכה יותר בכמויות מדויקות יותר בהערכת היעילות של מועמדים לסמים.

חלוקה לרמות של השגרה מיוצגת באיור 1. בקיצור, התאים העיקריים רקמת סרטן שופרה לתוך המדיום המלא לאחר העיכול עם או בלי תוספת של סרטן הלבלב מעכבי פיברוהפיצוץ. תאים סרטניים ופיברותקיעות היו מועשר כמו שתי אוכלוסיות נפרדות כי שולט שולט ללא מעכבי, ואת הצמיחה תאים ס...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

פרוטוקול זה מתאר הליכי אופטימיזציה במודל האנטי-וירוס מבוסס-פלואורסצנטית כפול שכותרתו הגידול מודל באמצעות זחל דג זברה כמארחים. מודל זה הטרוגנית מבע מחקה את הרכב הרקמה של מיקרוסביבה סרטן הלבלב ב vivo ומשמש ככלי מדויק יותר להערכת תגובות סמים בהתאמה אישית zpdx (zebrafish החולה נגזר מודלים מבע).

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

היום אנחנו הולכים להציג זחלים זברה PDX מודל. מודל זה הוא משמעותי כי הם יכולים לחקות טוב יותר הרכב הסלולר דומה xenograft להערכת תגובות סמים וגם משפר עוד יותר את העקביות של התוצאות עם הניתוח ההשוואתי שלנו. ישנם שני יתרונות עיקריים של טכניקה זו.ראשית, אנו משתמשים בצבעים כימיים סטנדרטיים שונים כדי לסמן תאים לתוך פלואורסצנטיות שונה, המאפשר מעקב בזמן אמת של הרכבים הסלולר ואת היכולת של שלב האנגרף. שנית, זה גם משפר את זמן ההישרדות הכללי של תאים אנושיים בזברה, השינוי הגנטי שלהם, אשר מספק חלון תצפית ארוך יותר לבדיקות סמים. טכניקה זו מספקת מודל פוטנציאלי לרפואה מותאמת אישית לחולים עם סרטן הלבלב וגם להערכה מוקדמת של תרופה לגידולים פרה-קליניים.שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לעקוב אחר תאים סרטניים אחרים או לא תא הגידול xenografted זברה ב vivo ולשפר את הישרדות התא במשך זמן תצפית ארוך יותר. כדי להכין את צלחת ההזרקה, להכין פתרון 50 מיליליטר של 1%agarose בתתכונה E3. מרתיחים את הפתרון עד שהתעוררות מתמוססת.יוצקים את כל הפתרון לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולאחר מכן מניחים את עובש קיבוע העובר זברה על פני השטח. כאשר הפתרון agarose מתגבש לחלוטין, להסיר את התבנית. כדי להכין מחטי הזרקה, השתמש מושך מחט למשוך נימי זכוכית 10 ס"מ עם מימד פנימי של 0.9 מילימטרים לתוך שתי מחטים.באמצעות מיקרוסקופ ומדפים, לחתוך את קצה המחט כדי ליצור פתח. ראשית, מניחים זוג אחד עד שניים של דגי זברה בוגרים במיכל הזדווגות בסביבות שבע עד תשע בערב. בשמונה בבוקר שלמחרת, לאסוף את הביציות המופריות. מעבירים את הביציות המופריות לצלחת פטרי המכילה 40 מיליליטר של תוסף E3 טרי.דגירה ב 28.5 מעלות צלזיוס. ראשית, להעביר את דגימת סרטן הלבלב שנאסף לתוך צלחת פטרי. לשטוף את הרקמה חמש עד שש פעמים עם PBS ולהשתמש אזמל לחתוך את הרקמה לחתיכות קוביות מילימטר אחד.לאחר מכן, להעביר את הרקמה מגוררת לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של HBSS. הוסף קולגנס מסוג ארבע, היאאלורודיניאז ו- DNAse אחד בריכוזים הסופיים המוצגים כאן. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%פחמן דו חמצני במשך 15 עד 20 דקות. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כל חמש דקות. הוסף שבעה מיליליטר של DMEM לצינור.צנטריפוגה ב 110 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, decant supernatant ולהשעות מחדש את תערובת הגידול ב- DMEM. צלחת התערובת לשתי מנות פטרי שישה סנטימטר המכיל שלושה מיליליטר של מדיה צמיחה מלאה בשם קבוצה אחת וקבוצה שתיים.דגירה שתי הקבוצות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%פחמן דו חמצני. לאחר 48 שעות, להוסיף מעכב 100x של פיברובלסטים סרטן הלבלב לתוך המדיום של קבוצה אחת כדי להסיר את fibroblasts מגודל, עוזב את התאים הסרטניים כמו סוגי התאים העיקריים. המשך דגירה באמצעות התנאים הקודמים.לאחר ייצור lentivirus, זרע את התאים להיות נגוע לתוך צלחת 12 באר עם 30 עד 40% צפיפות. תרבו את התאים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החלף את המדיום ב-500 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום המכיל פוליברן בריכוז של שמונה מיקרוגרם למיליליטר.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters נוספים של lentivirus למדיום דגירה שוב במשך 12 שעות. לאחר 12 שעות, להחליף את המדיום עם שני מיליליטר של מדיום מלא דגירה במשך 36 שעות נוספות.לאחר 36 שעות, בדקו את סמני הפלואורסצנטיות. לקצור את התאים הנגועים ולערבב אותם ביחס של אחד לאחד עם ריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 110 פעמים G במשך חמש דקות מחדש להשעות את תערובת התא ב 50 microliters של פתרון הזרקה.לאחר הרדמה של זחלי הזברה, מעבירים אותם לצלחת ההזרקה, המלאה ב- E3 שונה. קח 25 microliters של ההשעיה תא מעורב לתוך המחט microcapillary ולהכניס את המחט לתוך מניפולטור microinjection. הגדר את לחץ ההזרקה ואת הזמן ולהזריק 50 עד 80 תאים לתוך שם החלמון של 48 שעות לאחר ההפריה זברהפיש. ראשית, מעבירים את זחלי הזברה שלאחר הזנוגרפט ל-40 מיליליטר של תסריט מיקס ב-32 מעלות צלזיוס.מניחים 10 זחלים זנוגרפטים לתוך כל באר של צלחת 12 באר. לאחר מכן, חלקו את הזחלים לארבע קבוצות. פנקו בקבוצת הביקורת E3 המכילה 0.1%DMSO וטפלו בקבוצות האחרות באמצעות Gemcitabine ו/או Navitoclax.דגירה כל הזחלים ב 32 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לאחר הרדמה של הזחלים הזנוגרפטים לאחר הטיפול, מניחים אותם בתאית מתיל 3%. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי כדי לדמיין את הזחלים מהתצוגה הבין-ארצית.לאחר מכן, השתמש בתוכנת Image J ו- graph Pad כדי לכמת את עוצמת אותות הפלואורסצנטיות האדומים והירוקים. במחקר זה, תאי רקמת סרטן ראשוניים נזרעים לתוך בינוני מלא לאחר העיכול עם או בלי תוספת של מעכבי פיברובלסטים סרטן הלבלב. תאים סרטניים ופיברובלסטים מועשרים כשתי אוכלוסיות נפרדות.האוכלוסייה ללא מעכבים נשלטת על ידי fibroblasts בעוד צמיחת תאים סרטניים שוררת לאחר תוספת של מעכבים. שני וקטורים אריזה lentiviral בנויים אשר מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים או אדומים ב BCL2L1. תיוג הפלואורסצנטיות המבוססת על וירוסים מייצג את מצב ההישרדות של התאים.תאים סרטניים מעורבים fibroblasts מוזרקים לתוך שם חלמון זברה ב 48 שעות לאחר ההפריה ולאחר מכן מטופלים עם Gemcitabine ו / או Navitoclax במשך יומיים. הוויאציות התאיות באוכלוסיות שונות וההרכב התאי של הזנוגרפט משתנות כתגובות לטיפול התרופתי. בעת עיבוד סוגים שונים של גידולים, ישנם מספר שלבים שייתכן שיהיה צורך להתנגד, כולל זמן עיכול התא, מינון טיפול תרופתי, וכן הלאה.טכניקה זו מסייעת לחוקרים להעסיק דגי זברה ממבחן CGX או PDS סטנדרטי. זה מאפשר ערבוב והזרקה של תאים שונים ביחסים קבועים לכמת את רצועות ההתקדמות על ידי השוואתם לצמיחת תאים. הגנה אישית היא בעלת משמעות רבה, במיוחד כאשר אריזת lentivirus.ללבוש מסכות וכפפות בעת הצורך ולנסות לא לערבב על העור.

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Abstract