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* These authors contributed equally
Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.
Il ruolo emergente del microbioma intestinale in diverse malattie umane richiede una svolta di nuovi strumenti, tecniche e tecnologie. Tali miglioramenti sono necessari per decifrare l'utilizzo dei modulatori del microbioma per i benefici per la salute umana. Tuttavia, lo screening su larga scala e l'ottimizzazione dei modulatori per convalidare la modulazione del microbioma e prevedere i benefici relativi alla salute può essere praticamente difficile a causa della necessità di un gran numero di animali e/o soggetti umani. A tal fine, i modelli in vitro o ex vivo possono facilitare lo screening preliminare dei modulatori del microbioma. Qui, è ottimizzato e dimostrato un sistema di coltura microbiota fecale ex vivo che può essere utilizzato per esaminare gli effetti di vari interventi di modulatori di microbioma intestinale tra cui probiotici, prebiotici e altri ingredienti alimentari, oltre a nutraceutici e droghe, sulla diversità e la composizione del microbiota intestinale umano. L'inulina, uno dei composti prebiotici e modulatori del microbioma più studiati, viene utilizzato come esempio qui per esaminarne l'effetto sulla composizione sana del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche, come il pH fecale e i livelli fecali di acidi organici compresi gli acidi grassi lattati e a catena corta (SCFA). Il protocollo può essere utile per studi volti a stimare gli effetti di diversi interventi di modulatori sui profili microbiota fecale e a prevedere il loro impatto sulla salute.
Il microbiota umano è una comunità complessa composta da batteri, archei, virus e microbi eucarioti1, che abitano il corpo umano internamente ed esternamente. Prove recenti hanno stabilito il ruolo fondamentale del microbiota intestinale e del microbioma intestinale (l'intera raccolta di microbi e dei loro geni presenti nel tratto gastrointestinale umano) in varie malattie umane, tra cui l'obesità, il diabete, malattie cardiovascolari e il cancro1,2,3. Inoltre, i microrganismi che vivono nel nostro intestino producono un ampio spettro di metaboliti che....
INFORMATIVA: consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali appropriate e seguire le istruzioni e le linee guida per l'adeguata formazione sul livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Seguire tutti i passaggi di coltura secondo le regole standard di biosicurezza e utilizzare un cabinet BSL-2 utilizzando condizioni asettiche. Inoltre, campioni fecali provenienti da diversi modelli e soggetti umani possono avere il rischio potenziale di diffondere malattie microbiche. Immediatamente cercare aiuto medico nel verificarsi di eventuali lesioni e infezioni. Inoltre, l'uso di campioni di feci umane e animali dovrebbe essere approvato attraverso comitati etici istituzional....
Il protocollo è utilizzato per dimostrare l'effetto di un prebiotico specifico (cioè l'inulina sulla composizione del microbiota e sulle attività metaboliche in termini di cambiamenti nel pH fecale e la concentrazione di lattato e SCFA nelle feci di soggetti umani sani diversi punti temporali dopo il trattamento con inulina). Il pH fecale, i livelli fecali di lattato e SCFA (Figura1) e la composizione del microbiota (Figura 2 .......
Il modello di fermentazione dei liquami fecali in vitro qui presentato è un semplice modello monolotto per approssimare gli effetti di diversi substrati e ceppi microbici (ad esempio, prebiotici e probiotici) sulla composizione del microbiota fecale umano e la sua attività metaboliche in termini di pH fecale e livelli di SCFAs. I risultati qui presentati dimostrano che l'inoculazione dell'inulina diminuisce il pH fecale e aumenta significativamente i livelli di SCFA e lattato in esemplari fecali trattati inulina rispet.......
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto di finanziamento del Center for Diabetes, Obesity and Metabolism e del Clinical and Translational Science Center, della Wake Forest School of Medicine, del Department of Defense funding (Numero di sovvenzione: W81XWH-18-1-0118), la kermit Glenn Phillips II Presidente in Medicina Cardiovascolare; il National Institutes of Health ha finanziato il Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziato da P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e il Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziato da UL1TR001420), sono stati riconosciuti per fortuna. Ringraziamo anche i volontari per aver fornito ca....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
0.22 µm membrane filter | |||
AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
Bottle filter | Corning | ||
Cheesecloth | |||
Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
pH meter | |||
Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
Vortex | Thermoscientific | ||
Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
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