Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano

Riepilogo

Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.

Abstract

Il ruolo emergente del microbioma intestinale in diverse malattie umane richiede una svolta di nuovi strumenti, tecniche e tecnologie. Tali miglioramenti sono necessari per decifrare l'utilizzo dei modulatori del microbioma per i benefici per la salute umana. Tuttavia, lo screening su larga scala e l'ottimizzazione dei modulatori per convalidare la modulazione del microbioma e prevedere i benefici relativi alla salute può essere praticamente difficile a causa della necessità di un gran numero di animali e/o soggetti umani. A tal fine, i modelli in vitro o ex vivo possono facilitare lo screening preliminare dei modulatori del microbioma. Qui, è ottimizzato e dimostrato un sistema di coltura microbiota fecale ex vivo che può essere utilizzato per esaminare gli effetti di vari interventi di modulatori di microbioma intestinale tra cui probiotici, prebiotici e altri ingredienti alimentari, oltre a nutraceutici e droghe, sulla diversità e la composizione del microbiota intestinale umano. L'inulina, uno dei composti prebiotici e modulatori del microbioma più studiati, viene utilizzato come esempio qui per esaminarne l'effetto sulla composizione sana del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche, come il pH fecale e i livelli fecali di acidi organici compresi gli acidi grassi lattati e a catena corta (SCFA). Il protocollo può essere utile per studi volti a stimare gli effetti di diversi interventi di modulatori sui profili microbiota fecale e a prevedere il loro impatto sulla salute.

Introduzione

Il microbiota umano è una comunità complessa composta da batteri, archei, virus e microbi eucarioti¹, che abitano il corpo umano internamente ed esternamente. Prove recenti hanno stabilito il ruolo fondamentale del microbiota intestinale e del microbioma intestinale (l'intera raccolta di microbi e dei loro geni presenti nel tratto gastrointestinale umano) in varie malattie umane, tra cui l'obesità, il diabete, malattie cardiovascolari e il cancro^1,2,3. Inoltre, i microrganismi che vivono nel nostro intestino producono un ampio spettro di metaboliti che....

Protocollo

INFORMATIVA: consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali appropriate e seguire le istruzioni e le linee guida per l'adeguata formazione sul livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Seguire tutti i passaggi di coltura secondo le regole standard di biosicurezza e utilizzare un cabinet BSL-2 utilizzando condizioni asettiche. Inoltre, campioni fecali provenienti da diversi modelli e soggetti umani possono avere il rischio potenziale di diffondere malattie microbiche. Immediatamente cercare aiuto medico nel verificarsi di eventuali lesioni e infezioni. Inoltre, l'uso di campioni di feci umane e animali dovrebbe essere approvato attraverso comitati etici istituzional....

Risultati

Il protocollo è utilizzato per dimostrare l'effetto di un prebiotico specifico (cioè l'inulina sulla composizione del microbiota e sulle attività metaboliche in termini di cambiamenti nel pH fecale e la concentrazione di lattato e SCFA nelle feci di soggetti umani sani diversi punti temporali dopo il trattamento con inulina). Il pH fecale, i livelli fecali di lattato e SCFA (Figura1) e la composizione del microbiota (Figura 2 .......

Discussione

Il modello di fermentazione dei liquami fecali in vitro qui presentato è un semplice modello monolotto per approssimare gli effetti di diversi substrati e ceppi microbici (ad esempio, prebiotici e probiotici) sulla composizione del microbiota fecale umano e la sua attività metaboliche in termini di pH fecale e livelli di SCFAs. I risultati qui presentati dimostrano che l'inoculazione dell'inulina diminuisce il pH fecale e aumenta significativamente i livelli di SCFA e lattato in esemplari fecali trattati inulina rispet.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4	TGI	C2388	Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O)	Sigma-Aldrich	255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O)	Acros organics	2063450000	Toxic, Irritating
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4501
D-Pantothenic acid	Alfa Aesar	A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)	Biorad	1610729
DL-α-methylbutyrate	Sigma-Aldrich	W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O)	Sigma-Aldrich	F8263	Toxic
Folic acid	Alfa Aesar	J62937
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutyrate	Alfa Aesar	L04038
Isovalerate	Alfa Aesar	A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O)	Sigma-Aldrich	M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Niacin (Nicotinic acid)	Sigma-Aldrich	N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O)	Alfa Aesar	A14366	Toxic
N-valerate	Sigma-Aldrich	240370
P-aminobenzoic acid	MP China	102569	Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4)	Sigma-Aldrich	P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	1551128
Pyridoxine	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavin	Alfa Aesar	A11764
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	1613757
Sodium chloride (NaCl)	Fisher BioReagents	7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Chemicals	S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O)	Acros organics	206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)	Acros organics	148991000
Trypticase	BD Biosciences	211921
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O)	Sigma-Aldrich	Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads	Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore	Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter	Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer	Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit	Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter	InVitrogen
Vortex	Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system	Waters Corporation