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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.

Abstract

Il ruolo emergente del microbioma intestinale in diverse malattie umane richiede una svolta di nuovi strumenti, tecniche e tecnologie. Tali miglioramenti sono necessari per decifrare l'utilizzo dei modulatori del microbioma per i benefici per la salute umana. Tuttavia, lo screening su larga scala e l'ottimizzazione dei modulatori per convalidare la modulazione del microbioma e prevedere i benefici relativi alla salute può essere praticamente difficile a causa della necessità di un gran numero di animali e/o soggetti umani. A tal fine, i modelli in vitro o ex vivo possono facilitare lo screening preliminare dei modulatori del microbioma. Qui, è ottimizzato e dimostrato un sistema di coltura microbiota fecale ex vivo che può essere utilizzato per esaminare gli effetti di vari interventi di modulatori di microbioma intestinale tra cui probiotici, prebiotici e altri ingredienti alimentari, oltre a nutraceutici e droghe, sulla diversità e la composizione del microbiota intestinale umano. L'inulina, uno dei composti prebiotici e modulatori del microbioma più studiati, viene utilizzato come esempio qui per esaminarne l'effetto sulla composizione sana del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche, come il pH fecale e i livelli fecali di acidi organici compresi gli acidi grassi lattati e a catena corta (SCFA). Il protocollo può essere utile per studi volti a stimare gli effetti di diversi interventi di modulatori sui profili microbiota fecale e a prevedere il loro impatto sulla salute.

Introduction

Il microbiota umano è una comunità complessa composta da batteri, archei, virus e microbi eucarioti1, che abitano il corpo umano internamente ed esternamente. Prove recenti hanno stabilito il ruolo fondamentale del microbiota intestinale e del microbioma intestinale (l'intera raccolta di microbi e dei loro geni presenti nel tratto gastrointestinale umano) in varie malattie umane, tra cui l'obesità, il diabete, malattie cardiovascolari e il cancro1,2,3. Inoltre, i microrganismi che vivono nel nostro intestino producono un ampio spettro di metaboliti che....

Protocol

INFORMATIVA: consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali appropriate e seguire le istruzioni e le linee guida per l'adeguata formazione sul livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Seguire tutti i passaggi di coltura secondo le regole standard di biosicurezza e utilizzare un cabinet BSL-2 utilizzando condizioni asettiche. Inoltre, campioni fecali provenienti da diversi modelli e soggetti umani possono avere il rischio potenziale di diffondere malattie microbiche. Immediatamente cercare aiuto medico nel verificarsi di eventuali lesioni e infezioni. Inoltre, l'uso di campioni di feci umane e animali dovrebbe essere approvato attraverso comitati etici istituzional....

Representative Results

Il protocollo è utilizzato per dimostrare l'effetto di un prebiotico specifico (cioè l'inulina sulla composizione del microbiota e sulle attività metaboliche in termini di cambiamenti nel pH fecale e la concentrazione di lattato e SCFA nelle feci di soggetti umani sani diversi punti temporali dopo il trattamento con inulina). Il pH fecale, i livelli fecali di lattato e SCFA (Figura1) e la composizione del microbiota (Figura 2 .......

Discussion

Il modello di fermentazione dei liquami fecali in vitro qui presentato è un semplice modello monolotto per approssimare gli effetti di diversi substrati e ceppi microbici (ad esempio, prebiotici e probiotici) sulla composizione del microbiota fecale umano e la sua attività metaboliche in termini di pH fecale e livelli di SCFAs. I risultati qui presentati dimostrano che l'inoculazione dell'inulina diminuisce il pH fecale e aumenta significativamente i livelli di SCFA e lattato in esemplari fecali trattati inulina rispet.......

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto di finanziamento del Center for Diabetes, Obesity and Metabolism e del Clinical and Translational Science Center, della Wake Forest School of Medicine, del Department of Defense funding (Numero di sovvenzione: W81XWH-18-1-0118), la kermit Glenn Phillips II Presidente in Medicina Cardiovascolare; il National Institutes of Health ha finanziato il Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziato da P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e il Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziato da UL1TR001420), sono stati riconosciuti per fortuna. Ringraziamo anche i volontari per aver fornito ca....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGIC2388Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000Toxic, Irritating
Cysteine-HClSigma-AldrichC121800
D-biotinSigma-AldrichB4501
D-Pantothenic acidAlfa AesarA16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-methylbutyrateSigma-AldrichW271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263Toxic
Folic acidAlfa AesarJ62937
GlucoseSigma-AldrichG8270
HeminSigma-AldrichH9039
HepesAlfa AesarA14777
IsobutyrateAlfa AesarL04038
IsovalerateAlfa AesarA18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
Niacin (Nicotinic acid)Sigma-AldrichN4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366Toxic
N-valerateSigma-Aldrich240370
P-aminobenzoic acidMP China102569Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
PyridoxineAlfa AesarA12041
ResazurinSigma-AldrichR7017
RiboflavinAlfa AesarA11764
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
Sodium chloride (NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ChemicalsS320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O)Acros organics206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)Acros organics148991000
TrypticaseBD Biosciences211921
Vitamin B12Sigma-AldrichV2876
Yeast extractSigma-Aldrich70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beadsAgencourt
Anaerobic chamber with incubatoreForma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filterCorning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencerMiseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kitQiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeterInVitrogen
VortexThermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC systemWaters Corporation

References

  1. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  2. Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British ....

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