Arricchimento in un solo passaggio di un istone deacetilasi con tag TAP del fungo filamentoso Aspergillus nidulans per il saggio di attività enzimatica

Gli istoni di classe 1 (HDACs) come gli RpdA hanno acquisito importanza come potenziali bersagli per il trattamento delle infezioni fungine e per l'estrazione del genoma di metaboliti secondari fungini. Lo screening degli inibitori, tuttavia, richiede attività enzimatiche depurata. Dal momento che la classe 1 deacetilasi esercitano la loro funzione come complessi multiproteici, di solito non sono attivi quando espressi come singoli polipeptidi nei batteri. Pertanto, i complessi endogeni devono essere isolati, che, quando vengono applicate tecniche convenzionali come lo scambio ionico e la cromatografia di esclusione dimensionale, è laborioso e richiede molto tempo. La purificazione di affinità tandem è stata sviluppata come uno strumento per arricchire complessi multiproteici dalle cellule e quindi si è rivelato ideale per l'isolamento degli enzimi endogeni. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'arricchimento in singolo passaggio di complessi RpdA attivi attraverso il primo passo di purificazione di RpdA con tag C-Terminally da Aspergillus nidulans. I complessi purificati possono quindi essere utilizzati per il successivo screening degli inibitori applicando un saggio di deacetilasi. L'arricchimento proteico insieme al saggio di attività enzimatica può essere completato entro due giorni.