Одноэтапное обогащение крана-тегами Гистоун Деацетилаза из нитчатых грибков Аспергилласа niдулаанс для ферментативной активности анализа

Класс 1 гистоун деацетилаз (HDACs), подобный РКПК, приобрел значение как потенциальные мишени для лечения грибковых инфекций и для геномного майнинга грибковых вторичных метаболитов. Ингибитор скрининга, однако, требует очищенных ферментов деятельности. Так как деацетилазы класса 1 выполняют свои функции как мультипротеиновые комплексы, они обычно не активны, когда выражаются как одиночные полипептиды в бактериях. Таким образом, эндогенные комплексы должны быть изолированы, которые, когда применяются традиционные методы, такие как обмен иона и размер исключения хроматографии, трудоёмкие и отнимает много времени. Тандем очищение близость была разработана в качестве инструмента для обогащения мультипротеиновых комплексов из клеток и, таким образом, оказался идеальным для изоляции эндогенных ферментов. Здесь мы предоставляем подробный протокол для одноэтапного обогащения активных РКПК комплексов через первый этап очистки C-неизлечимо-меткой RpdA от Аспергилуса нидуанс. Затем очищенные комплексы могут быть использованы для последующего скрининга ингибитора с применением анализа деацетилазы. Обогащение белка вместе с ферментативной активностью анализа может быть завершена в течение двух дней.