وقد تم دعم هذا العمل من قبل: مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S.M.). المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC GNT123586) (S. M.)، جائزة أبحاث السكري الأسترالية الاستئمانية للألفية (Y17M1-MANS) (S.M.)، برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة الفيكتورية (S.M., A.D., E. T., M.S.), وNHMRC منحة الدراسات العليا APP1094337 وJDRF منحة الدكتوراه في المتابعة (M.S.).

وأعطى جميع الأشخاص موافقة مستنيرة قبل جمع الدم المحيطي. وقد منحت شركة سانت فنسنت هوسبيتال (HREC-A 135/08، وHREC-A 161/15) الموافقة الأخلاقية على التجارب التي تستخدم PBMC.
1. إعداد الكاشف
<ol><li>
وسائل الإعلام خلية T الإنسان
	<ol>
<li>إعداد وسائل الإعلام RP-5 لزراعة PBMC، والذي يتكون من RPMI 164...

<ol>
	<li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+effects+of+BrdU+and+3H-Thymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation,+position+and+fate.">Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).</li><li>Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation,+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection.">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106, 87-95 (2002).</li><li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).</li><li>Ten Brinke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+T-cell+responses+in+translational+studies:+Optimization+of+dye-based+proliferation+assay+for+evaluation+of+antigen-specific+responses.">Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).</li><li>Gillespie, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+TCR+Conservation+and+Altered+T+Cell+Cross-Reactivity+Characterize+a+B*57-Restricted+Immune+Response+in+HIV-1+Infection.">Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection.</a> Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).</li><li>Tynan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Structures+of+Highly+Bulged+Viral+Epitopes+Bound+to+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I:+Implications+for+t-cell+receptor+engagement+and+t-cell+immunodominance.">High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).</li><li>Blanchard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+aminopeptidase+associated+with+antigen+processing+defines+the+composition+and+structure+of+MHC+class+I+peptide+repertoire+in+normal+and+virus-infected+cells.">Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells.</a> Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).</li><li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specificity+groups+in+the+T+cell+receptor+repertoire+repertoire.">Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire.</a> Nature. 547, 94-98 (2017).</li><li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricks+with+tetramers:+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide+MHC.">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+cloning+human+autoantigen-specific+T+cells.">An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).</li><li>So, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin+C-peptide+is+an+autoantigen+in+people+with+type+1+diabetes.">Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).</li><li>Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Epstein-Barr+Virus+Growth-transformed+Lymphoblastoid+Cell+Lines.">Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).</li><li>Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expansion+of+high+or+low+avidity+cytotoxic+T+lymphocytes+and+efficacy+for+adoptive+immunotherapy.">Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).</li></ol>

الانتشار القائم على CFSE هو طريقة بسيطة وقوية للكشف عن وتعداد خلايا CD4+ T البشرية الخاصة بالمستضد. وقد ثبت سابقا أن استخدام التركيز الأمثل من CFSE أمر ضروري للحصول على أفضل النتائج4. فهناك الكثير من الـ CFSE يلغي الانتشار، في حين أن القليل جدا لا يسمح بتمييز الخلايا المقسمة وغير...

القدرة على الكشف عن ودراسة الخلايا T مستضد محددة مهم في دراسات الحصانة الخلية بوساطة. ومع ذلك، فإن القيام بذلك يشكل تحدياً كبيراً لاستجابات CD4+ الخلايا T الخاصة بمستضد تلقائي، والتي هي ضعيفة جداً ويصعب الكشف عنها. وهناك طريقة شائعة تستخدم للكشف عن انتشار الخلايا الليمفاوية مستضد محدد هو [3H]-thymidine، وهو النيوكليوتيد المسمى لاسلكيا المدرجة في الحمض النووي للخلايا المتكاثرة. على الرغم من أن اختبار [3H]-thymidine يمكن الكشف عن تخليق الحمض النووي، وهذا الأسلوب هو مقياس غير مباشر لتقسيم الخلايا، لأن تخليق الحمض النووي يمكن أن تبدأ بشكل مستقل عن الانقسام الانقسام (أي، أثناء ازدواجية الجينات والمبرمج1). وتتفاقم هذه المسألة من حقيقة أن انتشار الخلايا الخاصة بالمستضد يمكن أن يؤدي إلى وجود المبرمج ينوب شناطكبير ،مما يؤدي إلى احتمال المبالغة في تقدير الانتشار الخاص بالمستضد. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة [3H]-thymidine لا توفر معلومات فينوتيبيك لتكاثر الخلايا الليمفاوية، مثل CD4+ أو CD8+ انتشار النسب في PBMCs حفز مع الببتيدات المضادة للجينات.

الببتيد-MHC تترامر تلطيخ هو وسيلة تستخدم على نطاق واسع للكشف عن واستنساخ CD8 المضادة محددة+ خلايا T. هذا هو أسلوب راسخة7،8،9،10؛ ومع ذلك، يتطلب الاستنساخ القائم على رباعي اتترار معرفة موجودة بتقييد الظهارة/MHC، ويتطلب كل epitope رباعي11الخاص به ، مما يحد من نطاق اكتشاف واستنساخ الخلايا T الجديدة الخاصة بالظعوت. يمكن استخدام الانتشار القائم على CFSE مع الببتيدات أو البروتينات أو الليسات الخلوية. البروتوكول الموضح هنا بسيط وقوي على حد سواء، ويمكن فرز الخلايا CD4+ T المستجيبة للاستخدام في المصب الاختبارات التوصيف الوظيفي والكيميائية الحيوية12،13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-human CD4-AlexaFluor647</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317422</td>
			<td>RRID:AB_2716180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40010-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential amino acids (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human serum</td>
			<td>Australian Red Cross</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin C-peptide PI33-63</td>
			<td>Purar Chemicals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made synthetic peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetanus Toxoid protein</td>
			<td>Statens Serum Intitut</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferating human antigen-specific cd4+ t cells using carboxyfluorescein succinimidyl ester

وصف هو بسيط، في المختبر، طريقة تعتمد على تخفيف الصبغة لقياس انتشار الخلايا CD4+ T الخاصة بالمستضد في الخلايا أحادية النووية للدم المحيطي البشري (PBMCs). تطوير مستقرة، غير سامة، والأصباغ الفلورية مثل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) يسمح للخلايا T نادرة، مستضد محددة أن تكون متميزة عن المارة عن طريق التضاؤل في تلطيخ الفلورسنت، كما تم الكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي. ولهذه الطريقة المزايا التالية على النُهج البديلة: '1' أنها حساسة جداً للخلايا T ذات التردد المنخفض، '2' لا حاجة إلى معرفة المستضد أو الظهارة، '3' يمكن تحليل النمط الظاهري للخلايا المستجيبة، و'4' قابلة للتطبيق، وتستجيب يمكن فرز الخلايا واستخدامها لمزيد من التحليل، مثل استنساخ الخلايا T.

التحفيز في المختبر من PBMCs البشرية مع بروتين توكسويد التيتانوس: كانت ملطخة PBMCs مع CFSE وحفز لمدة 7 أيام في وجود توكسويد التيتانوس. وأظهرت جميع الجهات المانحة تقريبا استجابة قوية من الخلايا T إلى توكسويد التيتانوس لأنها قد تم تطعيمها، مما يجعل توكسويد التيتانوس مستضد اقويد إي?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester at JoVE.com

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

يعرض هنا بروتوكول لقياس تكاثر خلايا CD4+ T استجابة للبروتينات المضادة للجينات أو الببتيدات باستخدام تخفيف الصبغة. هذا الفحص حساس بشكل خاص للخلايا T النادرة الخاصة بالمستضد ويمكن تعديله لتسهيل استنساخ الخلايا الخاصة بالمستضد.

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

يوفر هذا البروتوكول منصة لدراسة استجابات خلايا CD4T التي تكون ضعيفة في كثير من الأحيان ويصعب اكتشافها. يسمح هذا الأسلوب للكشف عن تعداد وعزل خلايا CD4T دون معرفة مسبقة فيما يتعلق بالعرض antigen. الميزة الرئيسية هي تحليل خلايا CD4T التي غالبا ما تكون مجموعات نادرة المرتبطة بالظروف المناعة الذاتية مثل مرض السكري من النوع الأول.عند الحصول على عينة الدم المحيطية من متبرع سليم ، تمييع الدم في PBS بنسبة واحدة إلى اثنتين على الأقل قبل طبقات 35 ملليلتر من الدم أكثر من 15 ملليلتر من متوسط الكثافة الانحدارية في أنبوب 50 ملليلتر. فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة وإزالة ما يقرب من 20 ملليلتر من طبقة البلازما العليا الناتجة. ثم جمع طبقة خلايا الدم البيضاء مع الحرص على تجنب بيليه خلية الدم الحمراء وغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد.بعد العد، تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا أحادية النوى الدموية الطرفية السادسة أو PBMC لكل ملليلتر من تركيز PBS. إضافة 300 ميكرولترات من الخلايا لكل عنصر تحكم في أنابيب 10 ملليلتر الفردية. بعد تتصدر كل أنبوب مع برنامج تلفزيوني، رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز RP5 المتوسطة.ثم لوحة 100 ميكرولترات من الخلايا لكل عنصر تحكم إلى كل من ثلاثة آبار من 96 لوحة بئر تحتوي على 100 ميكرولترات من RP5 المتوسطة في البئر. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك، نقل PBMCs المتبقية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر وإضافة ميكرولتر واحد من حل المخزون العامل CFSE لكل ملليلتر من تعليق الخلية إلى جانب الأنبوب.عكس الأنبوب بسرعة عدة مرات لخلط الخلايا ووضعها في حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم باعتقال التفاعل مع خمسة ملليلترات من RP5 المتوسطة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في مرة واحدة 10 إلى PBMCs السادسة لكل ملليلتر من RP5 المتوسطة الطازجة وإضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى أنبوب واحد 10 ملليلتر لكل مستضد ليتم اختبارها.ثم إضافة 100 ميكرولترات من الخلايا لكل مستضد إلى كل من ثلاثة آبار من 96 بئر لوحة جيدا تحتوي على 100 ميكرولترات من RP5 المتوسطة تكملها مستضد مخفف من الفائدة في البئر. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام. لطخة مجموعات الخلايا CD4 + T لتحليل تدفق السيتوميترية، في نهاية الثقافة نقل كامل حجم الخلايا من كل بئر إلى الخلايا الفلورية تنشيط الفردية أو أنابيب FACS.غسل كل عينة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 0.1٪ مصل العجل الجنين أو FCS. Resuspend الكريات في المضادة المضادة المضادة للدم البشري مناسبة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد FCS لكل أنبوب. احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، وغسل العينات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS لكل أنبوب وإعادة تثبيت الكريات في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS. مباشرة قبل التحليل، إضافة ميكرولتر واحد من يوديد بروبديسيوم إلى كل أنبوب للسماح باستبعاد الخلايا الميتة. بوابة الخلايا الليمفاوية وفقا لمناطقها إلى الأمام والجانبية مبعثر.لاستبعاد الخلايا المبرمجة، بوابة منطقة التشتت الأمامية مقابل الخلايا السالبة لـ propidium iodide واستخدام الخلايا غير المُطَمَّعة لتعيين خط أساس جهد لخلايا غير فلورية. تعيين الفولتية لD4 الفلوروفور الأجسام المضادة وإشارة CFSE بحيث إشارة الفلورسنت هو أقل من 1000 لكل. استخدام التحكم اللون واحد CFSE وعينات CD4 لتأكيد إشارة الفلورسنت إيجابية لكل لون باستخدام الفولتية تعيين مع الخلايا غير الملطخة.كما CFSE وأوديد بروبيديوم بعض التداخل الطيفي، وضبط التعويض لطرح الفلوري يوديد بروبديوم من الفلورسينسي CFSE حتى العينة فقط CFSE لا تسفر عن إشارة في قناة يوديد بروبديدوم. عندما تم تحليل كافة العينات، حساب مؤشر تقسيم الخلية عن طريق قسمة عدد الخلايا المقسمة على 5000 الخلايا غير المقسمة من مجموعة مستضد حفزها من قبل متوسط عدد الخلايا المقسمة لكل 5000 الخلايا غير المقسمة من الخلايا المستنم دون مستضد. تقريبا جميع المتبرعين تظهر قوية T-الخلية استجابة لتيتانوس toxoid بعد تحفيز في المختبر لأن المتبرعين قد تم تطعيم مما يجعل الكزاز توكوكسيد مكافحة إيجابية مفيدة.ومع ذلك، فإن انتشار خلايا CD4+T من مراكز PBMCs غير المُحَرَّخة هو الحد الأدنى. بعد سبعة أيام من التحفيز مع الإنسان الموالية للأنسولين C-الببتيد, الموالية للأنسولين C-الببتيد محددة CD4 + T يمكن الكشف عن خلايا في الدم المحيطي للفرد مع نوع واحد من مرض السكري. PBMC حفز مع الأنفلونزا A بروتين مصفوفة الفيروس تثبت أيضا الانتشار.معا، وهذه البيانات تثبت أن يمكن إجراء مقايسة باستخدام البروتينات طول كامل فضلا عن الببتيدات الاصطناعية قصيرة. يمكن تنفيذ مكون FACS من هذه الطريقة باستخدام جهاز قياس تدفق الخلايا لفرز الخلايا. باستخدام فارز خلية، يمكن عزل الخلايا التائية الخاصة بمضادات المضادات على مستوى الخلية المفردة لتحليل المصب.وقد سمحت هذه الطريقة لاكتشاف استجابات الخلايا CD4T في الأفراد الذين يعانون من مرض السكري من النوع الأول في بداية مبكرة. تحليل هذه النادرة T-الخلية السكان باستخدام أساليب أخرى يطرح تحديات تقنية مختلفة.

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسان^{باستخدام} Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Abstract