Prelievo di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei topi

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per prelevare campioni di sangue dalla vena subclavia dei topi.

Abstract

Il topo è il principale modello di mammiferi per lo studio della malattia umana e della salute umana. Tuttavia, raccolta di campioni di sangue da topi è impegnativo nel lavoro di ricerca. La raccolta del sangue di coda è un metodo popolare quando è necessaria una piccola quantità di campione di sangue. L'arteria orbitale potrebbe essere considerata se è necessaria una grande quantità di sangue, ma questo metodo di raccolta del sangue ha problemi etici. In precedenza, abbiamo dimostrato la fattibilità e la sicurezza della raccolta dei campioni di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei ratti, e qui Indaghiamo se questo metodo potrebbe essere usato nei topi. Riportiamo che questo metodo è sicuro e pratico per la raccolta di sangue nei topi. La raccolta di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei topi può essere un metodo conveniente nelle opere di ricerca quotidiane.

Introduction

La raccolta di campioni di sangue dai topi è essenziale nella maggior parte dei laboratori di ricerca. Gli approcci convenzionali per la raccolta del sangue nei topi sono il taglio della coda quando sono necessari meno di 100 μL di campione¹. Tuttavia, se sono necessari più di 100 μL di sangue in un punto temporale non terminale, il sanguinamento retroorbitale, Submandibolare o la raccolta di sangue submentale sono le tecniche più comunemente considerate². In alcune occasioni, la cateterizzazione della vena giugulare attraverso un'incisione chirurgica è stata adottata come metodo alternativo³.

Tuttavia, i metodi di cui sopra sono dannosi per i topi. Al meglio delle nostre conoscenze, il metodo retroorbitale non è ampiamente accettato a causa del rischio potenziale di complicazioni^4,5. Trauma correlato all'operazione non solo accade nell'area visibile^6,7, ma anche in profondità all'interno dell'orbita⁶. Inoltre, la raccolta di sangue sottomandibolare è stressante⁸ e potrebbe essere associata a sanguinamento eccessivo^2,9. Sulla base della nostra precedente ricerca^10,11, qui introduciamo una nuova strategia per la raccolta del sangue dalla vena subclavia nei topi. La sicurezza, la fattibilità e il volume di sangue ottenuto con questa tecnica sono presentati e discussi.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università centrale del sud per la ricerca animale dal secondo Xiangya Hospital (Changsha, Cina). Il manoscritto è stato preparato secondo le linee guida di arrivo (ricerca animale: segnalazione di esperimenti in vivo)¹².

1. materiale e animale

1. Preparare i materiali richiesti: 75% etanolo, nastro adesivo, agente epilante, tubo da 2 mL, siringa da 1,0 mL collegata con ago (26G), bilancia elettronica, eparina e soluzione salina (vedere tabella dei materiali).
2. Animali: preparare 10 topi di Kunming, 6-8 settimane di età e di peso 21.6-28.3 g (Vedi tabella dei materiali). Mantenere i topi in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio¹³.

2. anestesia e posizionamento degli animali

1. Pesare il mouse per calcolare il dosaggio richiesto di agente anestetico.
2. Iniettare il pentobarbital di sodio (60 mg/kg) attraverso l'iniezione intraperitoneale per indurre l'anestesia generale¹⁴ (Figura 1). Applicare un unguento di lubrificazione oculare sterile all'inizio della procedura per evitare danni agli occhi esposti.
   Nota: i topi sono considerati sufficientemente anestetizzati quando non mostrano alcuna risposta del motore al test del riflesso del ritiro del pedale, della coda o del pizzico di pelle addominale.
3. Posizionare il mouse nel tavolo operativo in posizione supina e 2-4 cm di distanza dal bordo del tavolo per facilitare la puntura venosa (Figura 2). Fissare gli arti in una posizione comoda come mostrato in Figura 2. Non è necessaria alcuna intubazione o ventilazione meccanica nell'intera procedura.
4. Applicare l'agente di epilazione attorno allo spazio infraclavicolare con un batuffolo di cotone.
5. Tre minuti dopo, lavare l'agente epilatore con un batuffolo di cotone bagnato per rimuovere la pelliccia e qualsiasi sporcizia visibile.
6. Sterilizzare lo spazio infraclavicolare con 75% di etanolo e poi asciugare con garza pulita.

3. puntura della vena subclavia e raccolta del sangue

1. Identifica la posizione dell'osso della clavicola e la fossa sternale superiore con un dito.
2. Individuare il sito di puntura vicino al centro dell'osso della clavicola e caudale ad esso. Mettere il dito indice sinistro lateralmente al sito di puntura per fissare la pelle e il tessuto sottocutaneo (Figura 3).
3. Spostare l'ago verso l'alto e cranialmente verso la fossa sternale superiore. Una volta che l'ago entra nel tessuto sottocutaneo, muovere il dito anulare della mano destra all'indietro per formare una pressione negativa (Figura 3).
   Nota: durante questa fase, la posizione della mano destra dell'operatore dovrebbe essere leggermente inferiore rispetto alla tabella di funzionamento per far muovere l'ago verso l'alto e superiore al piano orizzontale. Questo è il motivo per cui l'animale è collocato vicino al bordo del tavolo.
4. Spostare la siringa in avanti 3-4 mm, ma interrompa se non c'è drenaggio di sangue nella siringa. Poi lentamente tirare indietro la siringa e mantenere la pressione negativa in esso. Nella maggior parte delle occasioni, il sangue entrerebbe nella siringa quando si disegna indietro.
5. Una volta che il sangue entra nella siringa, fissare la siringa e mantenere la pressione negativa fino a quando il volume richiesto (200 μL) di sangue viene raccolto nella siringa.
6. Dopo la raccolta del sangue, prelevare l'ago di puntura e premere leggermente il sito di puntura con un batuffolo di cotone per 1-2 minuti per fermare il sanguinamento. Poi, riportare i topi alla gabbia.
   Nota: occasionalmente, non si poteva ottenere il sangue al suo primo tentativo. Regolare la direzione dell'ago lateralmente e ripetere i passaggi 3.3-3.5. Se 3 tentativi non riescono a ottenere il campione di sangue, passare all'altro lato.
7. Trasferire il campione di sangue in un tubo eparinizzato.

4. recupero dei topi

1. Mentre l'anestesia pentobarbital è in vigore, il recupero di velocità fornendo supporto termico fino a quando il mouse si muove di nuovo.

Discussion

Questa relazione rappresenta un'estensione della precedente ricerca sul prelievo di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei ratti¹¹. Poiché il mouse è l'animale di ricerca più comunemente usato, sarebbe prezioso vedere se questa tecnica può anche essere applicata ai topi. La sfida deriva dal diametro relativamente più piccolo della vena subclavia.

Nella ricerca attuale, abbiamo scoperto che la puntura subclavia nei topi è un modo fattibile e affidabile per raccogliere il sangue. Rispetto ai metodi convenzionali come il taglio della vena di coda o la raccolta di sangue orbitale, non ci sono problemi etici del metodo attuale. Tutti gli animali sono sopravvissuti dopo questa procedura senza integratori liquidi dopo circa 200 μL di estrazione del sangue, e gli animali potrebbero essere utilizzati per ulteriori studi sperimentali. Teoricamente, l'estrazione totale del volume del campione non poteva raggiungere più del 10% del volume totale circolante di sangue ogni volta e il volume totale di un animale adulto è 55 a 70 mL/kg di peso corporeo⁵. Per i topi utilizzati in questa ricerca (21,6-28.3 g), l'estrazione del volume massimo dovrebbe essere di circa 200 μL. Impostiamo quindi la quantità di prelievo di sangue intorno 200 μL per ogni topo. L'incapacità di misurare la pressione sanguigna, la frequenza cardiaca e altri parametri di sollecitazione sono le principali limitazioni di questo rapporto.

Un'anestesia generale sufficiente è un'altra questione importante per garantire il successo della puntura. I topi devono rimanere silenziosi durante la procedura di puntura per evitare il rischio di ferire la nave dall'ago. Abbiamo scoperto che il pentobarbital sodico a 60 mg/kg per l'anestesia generale potrebbe soddisfare la profondità ideale di anestesia. Uno svantaggio di questo agente è il tempo di recupero relativamente lungo (media di circa 30 minuti). In alcuni istituti, l'inalazione di isoflurano viene utilizzata per il breve tempo di recupero e deve essere presa in considerazione come scelta di anestesia alternativa¹⁵.

La posizione della vena subclavia è mostrata nella Figura 4. A causa della parete sottile e della bassa pressione nella vena, la parete anteriore e posteriore della vena subclavia si attacca l'una all'altra sotto la pressione di un ago mentre l'ago si muove in avanti (Figura 5a). Mentre si ritira il pistone lentamente all'indietro, le pareti attaccate si separano spontaneamente e la punta dell'ago potrebbe penetrare nella vera cavità della nave e il sangue potrebbe scaricarsi nella siringa sotto pressione negativa sostenuta (Figura 5b). L'uso di un sistema di raccolta del sangue a vuoto¹⁶ potrebbe anche favorire la raccolta del sangue. A causa del diametro relativamente piccolo della vena subclavia topi, ci possono essere fallimenti anche per un operatore esperto. Per un novizio, si consiglia la puntura della vena subclavia nei ratti come riportato¹¹. Dopo diversi tentativi di puntura di successo nei ratti, il tasso di successo della puntura della vena subclavia nei topi potrebbe essere significativamente migliorato. Assicurarsi che la posizione esatta della puntura sia solo caudale al centro dell'osso della clavicola. L'ago che si muove verso l'alto e il cranio verso la fossa sternale superiore sono altri punti chiave per garantire una puntura di successo.

In conclusione, la puntura della vena subclavia è un metodo sicuro ed efficace per la raccolta del sangue nei topi. Oltre al taglio della vena di coda e alla raccolta di sangue del plesso retro-orbitale, questo metodo è fattibile, sicuro e adatto per ricerche osservazionali in diversi punti temporali nei topi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
75% ethanol	Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University	made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity
adhesive tape	3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany)	1534-1
canvas gloves	for anesthesia
electronic scale	Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China)	KP-3000
epilating agent	France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China)	8281744
heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU)	Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China)	H32025851
mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China)	Kunming spcies
needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
pentobarbital sodium (used solution 1%)	Merck	P-010-1ML
physiological saline, 100 mL	Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China)	H43020454
stastical software	International Business Machines	SPSS Statistics 25
tube, 2 mL	Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China)	MCT-150-C