Karakterisering van eiwitten door grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)

Analytische grootte-uitsluiting chromatografie (SEC), vaak gebruikt voor de bepaling van het molecuulgewicht van eiwitten en eiwit-eiwitcomplexen in oplossing, is een relatieve techniek die berust op de elutie volume van de analyt te schatten moleculaire Gewicht. Wanneer het eiwit niet bolvormig is of niet-ideale kolom interacties ondergaat, is de kaliberbepalingskromme die op eiwit normen wordt gebaseerd ongeldig, en het moleculaire gewicht dat van elutie volume wordt bepaald is onjuist. Multi-Angle lichtverstrooiing (MALS) is een absolute techniek die het molecuulgewicht van een analyt in oplossing van fundamentele fysische vergelijkingen bepaalt. De combinatie van SEC voor de scheiding met MALS voor analyse vormt een veelzijdig, betrouwbaar middel voor het karakteriseren van oplossingen van een of meer eiwit soorten, waaronder monomeren, inheemse oligomeren of aggregaten, en heterocomplexes. Aangezien de meting wordt uitgevoerd op elk elutie volume, SEC-MALS kan bepalen of een eluting piek is homogeen of heterogeen en onderscheid te maken tussen een vaste molecuulgewicht distributie versus dynamisch evenwicht. Analyse van gemodificeerde eiwitten zoals glycoproteïnen of lipoproteïnen, of geconjugeerde, zoals detergent-solubilized membraaneiwitten, is ook mogelijk. Vandaar, SEC-MALS is een kritisch instrument voor de eiwit chemicus die moet bevestigen de biofysische eigenschappen en de oplossing gedrag van moleculen geproduceerd voor biologisch of biotechnologisch onderzoek. Dit protocol voor SEC-MALS analyseert het molecuulgewicht en de grootte van zuivere eiwit monomeren en aggregaten. De verkregen gegevens dienen als basis voor verdere SEC-MALS analyses, waaronder die van complexen, glycoproteïnen en oppervlakteactieve-gebonden membraaneiwitten.