In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Elke familie pokkenvirus mRNA die na virale replicatie van DNA wordt getranscribeerd heeft een evolutionair behouden, niet-malplaatjed 5 '-poly (A) leider in 5 '-UTR. Om de rol van 5 '-poly (A) leider in mRNA vertaling tijdens familie pokkenvirus besmetting te ontleden ontwikkelden wij een in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Deze reporter assay bestaat uit vier kern stappen: (1) PCR om de DNA-template voor in vitro transcriptie te versterken; (2) transcriptie in vitro om mRNA te produceren gebruikend de polymerase van RNA (3) transfectie om in vitro getranscribeerd mRNA in cellen te introduceren; (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling. De RNA-based Luciferase reporter assay beschreven hier omzeilt kwesties van plasmide replicatie in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen en cryptische transcriptie van de plasmide. Dit protocol kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-elementen in een mRNA met inbegrip van 5 '-UTR en 3 '-UTR in andere systemen dan familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen te bepalen. Bovendien kunnen verschillende vormen van vertaling initiatie zoals Cap-afhankelijke, Cap-onafhankelijke, re-initiatie, en interne initiatie worden onderzocht met behulp van deze methode.