Biz Katrine Franklin Mark ve Annette Bartels için mükemmel teknik yardım ve Asbjørn Nøhr-Nielsen şekil 1D deneyler gerçekleştirmek için minnettarız. Bu çalışma Einar Willumsen Vakfı, Novo Nordisk Vakfı ve Fondation Juchum (tüm SFP için) tarafından finanse edildi.

1. kürler üretimi
<ol><li>Hücre süspansiyonları için küroid oluşumu hazırlanması Not: farklı hücre hatları çok farklı yapışma özelliklerine sahiptir ve her durumda en uygun küroid oluşumu Protokolü kurulmalıdır. Biz MCF-7 ve BxPC-3 hücrelerin spontan küre oluşumu için uygun olduğunu bulduk, MDA-MB-231, SKBr-3, panc-1 ve MiaPaCa başarıyla küroidler oluşturmak için reconstituted Bodrum membran ilavesi gerektirir. Asılı bırakma protokolü için yalnızca MDA-MB-231 v...

3D kanser hücresi kürüler kullanımı sadece antikanser ilaç taraması için değerli ve çok yönlü bir araç kanıtlanmıştır, aynı zamanda tümör bu taklit koşullar altında kanser hücresi ölüm ve canlılığı düzenlenmesi içine mekanik fikir kazanmak için Mikro. Bu özellikle erişilebilirlik, hücresel alımı ve kemoterapötik ilaçların hücre içi etkileri gibi tümör, pH, oksijen gerilimi, tortuluk ve fiziksel ve fiziko-kimyasal koşullar tarafından derinden etkilenir çok önemlidir kimyasal...

Kanser biyolojisinde çok hücreli küre modellerinin kullanımı birkaç yıl eski1,2, ama son yıllarda önemli momentum kazanmıştır. Büyük ölçüde, bu kanser hücrelerinin phenoype onların mikroçevre ve spesifik büyüme koşullarına bağlı olduğu ne kadar güçlü farkındalığını arttırmaktadır. Solid tümörlerde mikroçevre, karşılık gelen normal dokularda temelde farklıdır. Bu pH gibi fiziko-kimyasal koşulları içerir, oksijen gerilimi, yanı sıra interstisyel basınç, besin gibi çözünür faktörlerin konsantrasyon degradeler, atık ürünler, ve salgılanmış sinyalizasyon bileşikleri (büyüme faktörleri, sitokinler). Ayrıca, hücre içi matris (ECM), hücreli hücre etkileşimleri ve hücresel sinyalizasyon organizasyonu ve tümör3,4, belirli üç boyutlu (3D) mimarisi diğer yönlerini içerir 5,6. Kanser hücrelerinin mevcut olduğu spesifik mikroçevresel koşullar, gen ifade profilini ve fonksiyonel özelliklerini derinden etkiler ve 2D 'de yetiştirilen hücrelerle karşılaştırıldığında, 3D kürelerinin fenotipini çok daha yakından taklit ettiği açıktır. In vivo tümörleri7,8,9,10,11. 2D modelleri, hipotoksi, Asidik pH ve yüksek laktat konsantrasyonları tümör mikroortamın bilinen yönlerini taklit etmek bile, hala tümör içinde doğan fizico-Kimyasal parametrelerin degradeleri yakalamak için başarısız, yanı sıra onların 3D tümör Mimari. Öte yandan, hayvan modelleri, pahalı, yavaş ve etik problemli, ve genellikle, aynı zamanda insan tümörü koşullarını tekrar etme yeteneğinde eksiklikleri vardır. Sonuç olarak, 3D Kürtler en katı kanserlerin çoğu özellikleri geniş bir yelpazede çalışmalarda bir ara karmaşıklık modeli olarak uygulanmıştır9,11,12,13, 14,15,16,17.
3B kürlerin yaygın olarak istihdam edilmesi, antikanser terapisi etkinliğini9,18,19,20' ye göre taramasında yer almaktadır. Tedavi tepkiler özellikle tümör mikroortama duyarlıdır, hem tortuların etkisini yansıtan, kısıtlı difüzyon, yüksek interstisyel basınç, ve ilaç teslim asidik çevresel pH, ve hipoksi ve diğer etkisi hücre ölüm tepkisi üzerinde mikroçevre yönleri9,17. 3D küre içerisindeki çevre, tüm bu özellikleri7,8,9,10,11olarak geliştirdiğinden, 3D hücre kültürlerini istihdam edebilir sonuçların in vivo koşullarına çevirisini önemli ölçüde iyileştirebilir, ancak net büyümenin verimli ve uygun maliyetli yüksek verim taramasına izin verir. Ancak, kanser hücrelerinin ilaç tepkisi üzerinde çalışmaların büyük çoğunluğu hala 2D koşullar altında gerçekleştirilir. Bu büyük olasılıkla, bazı deneyleri nispeten kolayca 3D hücre kültürler için uygulanabilir iken, birçok, gibi canlılığı gibi, Batı blotting, ve immünofluorescence analizi, çok daha uygun 2D 3D daha yapılır.
Mevcut çalışmanın amacı, Anti-kanser ilaçları ile tedavinin etkisinin analiz edilmesi için, 3 boyutlu bir tümördeki ayarı taklit eden kanser hücresi kalabilirlik ve hayatta kalma konusunda kolayca sağlamlık ve hassas protokoller sağlamaktır. Özellikle, biz sağlamak ve küresel oluşumu için üç farklı yöntemler karşılaştırmak, büyüme, canlılığı ve ilaç tepkisi nitel ve niceliksel analizler için yöntemler izledi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:264px;"># C10595&#160;</td>
			<td style="width:336px;">For staining nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">5-Fluorouracil (5-FU)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#F6627</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:284px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:264px;">#E3111</td>
			<td style="width:336px;">Inhibitor of NHE1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against PARP and cPARP</td>
			<td style="width:284px;">Cell signaling</td>
			<td>#9542</td>
			<td style="width:336px;">Used in western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against Ki-67</td>
			<td style="width:284px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:264px;">#9449</td>
			<td style="width:336px;">Used for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against p53</td>
			<td style="width:284px;">Cell Signaling&#160;</td>
			<td style="width:264px;">#2524&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against &#946;-actin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:264px;">A5441</td>
			<td style="width:336px;">Used in western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Bactoagar</td>
			<td style="width:284px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:264px;">#214010</td>
			<td style="width:336px;">Used for agarose gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Benchmark protein ladder</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td>#10747-012</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bio-Rad DC Protein Assay kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&#160;&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for protein determination from lysates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td style="width:284px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:264px;">610311</td>
			<td style="width:336px;">For cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">BX63 epifluoresence microscope</td>
			<td style="width:284px;">Olympus</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:284px;">Promega</td>
			<td style="width:264px;">#G9681</td>
			<td style="width:336px;">Used for the cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#P4394&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:408px;">Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,&#160; Ultra-low attachment, With lid, Sterile</td>
			<td style="width:284px;">Corning</td>
			<td style="width:264px;">#4520</td>
			<td style="width:336px;">Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:408px;">Corning 96 well, clear round bottom,&#160; Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile</td>
			<td style="width:284px;">Corning</td>
			<td style="width:264px;">#7007</td>
			<td style="width:336px;">Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Criterion TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:264px;">5671025</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">Doxorubicin</td>
			<td style="width:284px;">Abcam</td>
			<td style="width:264px;">#120629</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">FLUOStar Optima Microplate reader</td>
			<td style="width:284px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for recording luminescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:284px;">VWR Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:264px;">#9713.1000&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:408px;">Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:284px;">Gibco</td>
			<td style="width:264px;">#A1413202</td>
			<td style="width:336px;">Keep at 4 &#176;C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:264px;">#F9665</td>
			<td style="width:336px;">Serum for growth media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:408px;">ImageJ</td>
			<td style="width:284px;">NIH</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Scientific Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Medim Uni-safe casette</td>
			<td>Medim Histotechnologie</td>
			<td>10-0114</td>
			<td style="width:336px;">Used for storage of embedded spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Mini protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:284px;">Roche Diagnostics GmBH&#160;</td>
			<td style="width:264px;"># 11836153001</td>
			<td style="width:336px;">Used for lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">MZ16 microscope</td>
			<td style="width:284px;">Leica</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for light microscopic images</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NuPAGE LDS 4x Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#NP0007</td>
			<td style="width:336px;">Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pierce ECL Western blotting substrate</td>
			<td style="width:284px;">Thermo scientific</td>
			<td>#32106</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P7170-1L</td>
			<td style="width:336px;">Used for protein band staining</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:284px;">Graphpad</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Propidium iodide (1mg/ml solution in water)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Light sensitive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Sterile reservoirs, multichannel</td>
			<td style="width:284px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:264px;">21002</td>
			<td style="width:336px;">Used for seeding cells for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide&#160;</td>
			<td style="width:284px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:264px;">#J3800AMNZ</td>
			<td style="width:336px;">Microscope glass slide used for embedding</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#T5648</td>
			<td style="width:336px;">Used as chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trans-blot Turbo 0.2 &#181;m nitrocellulose membranes</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad</td>
			<td>#170-4159</td>
			<td style="width:336px;">Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Tris/Glycine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad&#160;</td>
			<td>#161 0732</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:284px;">Sigma</td>
			<td>#T4174&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell viability and death in 3d spheroid cultures of cancer cells

Kanser hücrelerinin üç boyutlu kürüler hem kanser ilaç ekranları için önemli araçlar ve kanser hücresi biyoloji içine mekanik fikir kazanmak için. Bu preparatın gücü, hızlı, ucuz ve nispeten yüksek verim taramasına izin verecek kadar çok yönlü olmakla beraber, tümörün in vivo koşullarının birçok yönünü taklit etme yeteneğiyle yatıyor. Küroid kültürü koşulları, bir tümördeki fiziko-kimyasal degradeleri, artan ekstrellüler asitliği, artan lakdamak, ve glikoz ve oksijen kullanılabilirliğini azaltarak, küre çevresinden çekirdeğine kadar tekrar edebilir. Ayrıca, in vivo tümörlerin mekanik özellikleri ve hücre hücre etkileşimleri kısmen bu model tarafından taklit edilmiştir. Özel özellikleri ve sonuç olarak en iyi büyüme koşulları, 3D kürler, farklı kanser hücrelerinin türleri arasında farklıdır. Ayrıca, 3D Kürklerde hücre cancılığı ve ölümün değerlendirilmesi, 2D kültürler için istihdam edenler kısmen farklılık yöntemleri gerektirir. Burada kanser hücrelerinin 3D kürleri hazırlamak için çeşitli protokoller açıklamak ve antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek bağlamında hücre canlılığı ve ölüm değerlendirmek için bu tür kültürler kullanmak için.

Şekil 1A ve Şekil 1B'de şematik olarak gösterilen küroid oluşumu protokolüne dayalı olarak küre büyüme, Anti-kanser ilaç tedavilerinin 3D tümördeki etkilerini analiz etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. ayar taklit. Hangi kürler oluşturulur kolaylığı hücre hattına özeldir ve bazı hücre hatları tutarlı kürler22oluşturmak Için RBM ile takviyesi gerekt...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells at JoVE.com

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Burada sunulan protokoller 3D kültür için optimize edilmiş ve kanser hücresi büyümesi ile ilişkili süreçlerin verimli ve uygun fiyatlı soruşturma için izin, çoğalma, ve 3D bir ortamda ölüm. 3D kültürünü kullanmanın en önemli avantajları, tümör mikroortamının in vitro temel yönlerini yeniden özetlemek için benzersiz bir olasılık olmasıdır. 3D spheroid kanser ilaç tarama için önemli bir araçtır, giderek kanser tedavisi araştırmainda in vitro ve in vivo koşullar arasında çeviri geliştirmek için kullanılmaktadır.Protokollerin bazıları belirli bir miktar pratik ve beceri gerektirir. Bu özellikle el damlası yöntemi ile küresel üretmek için doğrudur, ve immünohistokimya için küresel katıştırma için. Bu yordamların temel unsurlarını yazılı olarak açıklamak zor olduğundan, örneğin bir damla agarose'a nasıl spheroidlerin yerleştirilen gibi, görsel gösteri araştırmacıların bu prosedürleri gerçekleştirmelerine yardımcı olacaktır.En iyi hücre yoğunluğunu elde etmek için hazırlanan hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpte seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu steril bir rezervuara aktarın ve önceden hazırlanmış tabağa 200 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı pipet kullanın. %5 karbondioksit ve %95 nem oranı ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.Her 2-3 günde bir, küresel lerin hafif mikroskobik görüntülerini elde edin. Görüntüleri aldıktan sonra, harcanan ortamın 100 mikrolitresini her kuyudan çıkarın ve 100 mikrolitre taze ortamla değiştirin. İlk olarak, buz üzerinde yeniden oluşan bodrum zarı çözülme.Kullanmadan önce ayrı ayrı sarılmış plakaları ve rezervuarları buz üzerinde saklayın. Daha sonra, en iyi hücre yoğunluğuelde etmek için 15 mililitrelik bir tüp içinde hazırlanan hücre süspansiyon seyreltmek. Seyreltilmiş hücre süspansiyonu içeren tüpü buz üzerine yerleştirin.Plastik kapları buzla doldurun ve kaputa aktarın. Soğutulmuş tabakları ve rezervuarları bir hücre kültürüne aktarın. Plakaları ve rezervuarları tekrar buza koyun.Homojen bir jel sağlamak için rBM'yi nazikçe yeniden askıya alın. Soğutulmuş hücre süspansiyonlarına rBM'nin optimum konsantrasyonunu ekleyin. rBM ve hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde karıştırıldığından emin olmak için tüpü ters çevirin.Daha sonra, steril bir rezervuar bu karışımı aktarın ve soğutulmuş, ultra-düşük eki, 96-iyi plaka her kuyuya 200 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı pipet kullanın. RBM sertleştiğinde hücrelerin bir araya toplandığından emin olmak için plakayı 750 kez g'de 15 dakika santrifüj edin. Santrifüj yumuşak iniş veya minimal frenleme işlevini kullanın.İlk olarak, bir hücre kültür çanak PBS altı mililitre ekleyin. Uygun bir seyreltme elde etmek için hazırlanan hücre süspansiyon seyreltmek. Pratik bir seyreltme mililitre başına 50.000 hücredir.Hücre süspansiyonu steril bir rezervuara dökün ve hücre kültür yemeğinin kapağına 30 damla kadar süspansiyonu dikkatlice yerleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın ve bu da damla başına 2000 hücre konsantrasyonu yla sonuçlanır. Hızlı ama kontrollü bir hareketle, kapağı ters çevirin ve PBS içeren hücre kültürü yemeğinin üzerine yerleştirin. 4-6 gün boyunca %5 karbondioksit ve %95 nem ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.Eğer küresel ler protein lisates veya embedding için kullanılacaksa, kapağı çıkararak, yatırarak ve damlaları bir mililitre ısıtılmış ortamla yıkayarak çekin. Elde edilen küresel içeren ortamı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Protein lisates veya katıştırma ile devam etmeden önce spheroid tüpün altına yerleşmek sağlar.P200 pipet ucunu kesilerek küresel leri yapılarını bozmadan daha kolay yakalayın. Her durum için, 1.5 mililitrelik tüp içinde 18 ve 24 küresel ler arasında ideal olarak 12 en az çekin. Buz tüpleri yerleştirin ve küresel lerin alt yerleşmek için izin.Daha sonra, steril hücre laboratuvarından normal laboratuvara geçin. Her yıkama adımı arasında PBS çıkarmadan önce spheroids yerleşmek emin olun, buz gibi bir x PBS bir mililitre iki kez spheroids yıkayın. Daha sonra, rahatsız edici veya küresel çıkarmadan mümkün olduğunca çok PBS aspire.Fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile beş mikrolitre ısıtılmış lysis tampon ekleyin. Girdap 30 saniye boyunca küresel ve daha sonra 10 saniye için hızlı bir santrifüj gerçekleştirin. Bu girdap ve santrifüj aralıklarını beş ila 10 dakika veya küresel ler eriyene kadar tekrarlayın.PI çözeltisini hazırladıktan sonra, 96 kuyulu plakadaki her kuyudan 100 mikrolitre orta yıkın ve küresel leri çıkarmamaya özenin. Her kuyuya 100 mikrolitre ısıtılmış bir X PBS ekleyin ve ardından kuyulardan 100 mikrolitre sıvı çıkarTın. Kalan orta yıkayın için bu yıkama adımÜç kez tekrarlayın.Ardından, her kuyuya 100 mikrolitre PI çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla 37 santigrat derece 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, PI çözeltisini yıkamak ve görüntüleme yaparken arka plan sinyalini azaltmak için, daha önce açıklandığı gibi, ısıtılmış bir X PBS ile yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Epifloresan mikroskobu kullanarak, küresel leri görüntüle. Görüntüleme yazılımı içinde, çok kanallı menüyü açın. İlgili kanalların pozlama süresini ayarlayın ve her kanalı ayarladıktan sonra Okuma Ayarları'na basın.Z yığını menüsünü açın ve görüntü odağı ayarlayarak başlangıç ve bitişi tanımlayın. Başlangıçta odak dışında küresel var, daha sonra görüntü bir kez daha bulanık hale gelene kadar tüm küresel boyunca odak noktası hareket ettirin. Ardından adım boyutunu 18 ila 35 mikrometre arasında ayarlayın ve Başlat tuşuna basın.Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi ilk gün duman kaputunda küresel leri düzeltin. İkinci gün, agarose jeli mikrodalga fırında su dolu bir kabın içine yerleştirin ve jeli 60 dereceye kadar bir banküstü ısıtma plakasında sıcak tutun. Her bir mililitre buz gibi bir X PBS kullanarak duman kaputunda iki kez sferoidleri yıkayın.Sonra, PBS en aspire. Daha büyük bir delik ile sivri bir ucu elde etmek için bir eğim de keserek 20 mikrolitrelik pipet ucu hazırlayın. Bundan sonra, bir mikroskop slayt üzerinde bir agarose jel damla olun.Agarose katılaşmasını önlemek için sıcak bir ısıtma bloğu üzerine slayt yerleştirin. Modifiye pipet ucunu kullanarak, 15 ila 20 mikrolitrelik bir hacimde mümkün olduğunca çok küresel madde yakalayın. Mikroskop kaydırağını dokunmamak için küresel leri agarose jel damlasının ortasına dikkatlice enjekte edin.Oda sıcaklığında veya dört derecede beş ila 10 dakika agarose jel sertleşmek için inkübate. Jel damla biraz katılaşmış olduğunda, ama yine de oldukça yumuşak, dikkatle plastik bir doku kasetiçine mikroskop slayt itmek için bir neşter kullanın. Doku kasetini etanol dolu bir kabına aktarın ve oda sıcaklığında saklayın.Bu çalışmada, 3D kültürde kanser hücresi canlılığı ve ölüm anti-kanser tedavisine bağlı değişikliklerin analizi için bir dizi yöntem sunulmuştur. Eklenen rBM konsantrasyonu küresellerin morfolojisini derinden etkileyebilir. %2.5'e kadar rBM eklenmesi, SKBr-3 meme kanseri hücrelerinde küresel oluşumuna izin verir ve daha yüksek konsantrasyonlarda başka bir etki yoktur.Buna karşılık, BxPC-3 pankreas kanseri hücreleri kendiliğinden küçük kompakt sheroidler oluşturur. Bu hücre tipinde rBM'nin %1.5 veya üzerinde arttırılması, spheroid'den çıkıntılı ve invaginsi olan daha kıvrımlı yapılara farklı bir morfolojik değişim sağlar. Kemoterapi etkinliğinin taranması için küresel kültürlerin kullanımına bir örnek burada gösterilmiştir.MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde %50 azaltılmış canlılık için gerekli dozu belirlemek için yapılan bir doz yanıt deneyi sırasında ışık mikroskop görüntüleri her iki ila üç günde bir elde edilir. Ölü hücrelerin bir inhibitör konsantrasyonu üzerine mekansal düzenleme PI boyama kullanılarak görselleştirilmiş olabilir. Görüldüğü gibi, kontrol spheroidler sınırlı nekrotik göstermek, geç apoptotik çekirdek, ölü hücreler inhibitör konsantrasyonu arttıkça küresel boyunca dağıtılır ise.Burada gösterilen küresel teknik, 3D invazyon, göç veya mikroforetik analiz gibi diğer birçok teste uygulanabilir. Ayrıca fibroblast, adipositler veya bağışıklık hücreleri ile ortak kültürler için de geçerlidir, hangi tümör mikroortamda hücresel etkileşimler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu tekniğin gelişimi, gen ekspresyonu, invazyon ve tedavi yardımı da dahil olmak üzere, kanser gelişiminin çeşitli yönlerinde tümör mikroortamının rolünün aydınlatIlmesinde çok önemli olmuştur.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Abstract