Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge fasi nucleari e citoplasmatiche e l'ultimo passo si verifica in un compartimento nucleare chiamato corpo di Cajal. Tuttavia, le sequenze che indirizzano la localizzazione dello snRNA in questa struttura subnucleare non sono note fino a poco tempo fa. Per determinare sequenze importanti per l'accumulo di snRNA nei corpi di Cajal, abbiamo impiegato microiniezione di snRNA fluorescenti etichettati in modo fluorescente seguito dalla loro localizzazione all'interno delle cellule. In primo luogo, abbiamo preparato mutanti di delezione snRNA, sintetizzato modelli di DNA per la trascrizione in vitro e snRNA trascritti in presenza di UTP accoppiati con Alexa488. Gli snRNA etichettati sono stati miscelati con 70 kDa-Dextran coniugati con TRITC, e microiniettati al nucleo o al citoplasma delle cellule umane di HeLa. Le cellule sono state incubate per 1 h e fissa e la bobina del marcatore del corpo di Cajal è stata visualizzata mediante immunoororescenza indiretta, mentre snRNA e dextran, che funge da marcatore di iniezione nucleare o citoplasmica, sono stati osservati direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo metodo consente di testare in modo efficiente e rapido il modo in cui le varie sequenze influenzano la localizzazione dell'RNA all'interno delle cellule. Qui, mostriamo l'importanza della sequenza di legame Sm per una localizzazione efficiente degli snRNA nel corpo di Cajal.