In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in biologischen Prozessen wie Transkription, Rekombination und RNA-Stoffwechsel. Experimentelle Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erfordern die Verwendung von Fluoreszenz-Tags, radioaktiven Isotopen oder anderen Etiketten, um bestimmte Zielmoleküle zu erkennen und zu analysieren. Biotin, ein nicht-radioaktives Nukleinsäurelabel, wird häufig in elektrophoretischen Mobilitätsschicht-Assays (EMSA) verwendet, wurde aber nicht regelmäßig zur Überwachung der Proteinaktivität während Nukleinsäureprozessen eingesetzt. Dieses Protokoll veranschaulicht den Nutzen der Biotinkennzeichnung während in vitro enzymatischer Reaktionen und zeigt, dass dieses Etikett gut mit einer Reihe von verschiedenen biochemischen Assays funktioniert. Insbesondere wird in Übereinstimmung mit früheren Befunden mit Radioisotop ³²P-markierten Substraten über biotin-markiertes EMSA bestätigt, dass MEIOB (ein Protein, das speziell an der meiotischen Rekombination beteiligt ist) ein DNA-bindendes Protein ist, RNA-Helicase) löst biotinmarkierte RNA-Duplexstrukturen auf und dass MEIOB biotinmarkierte einsträngige DNA spaltet. Diese Studie zeigt, dass Biotin in der Lage ist, ³²P in verschiedenen Nukleinsäure-bezogenen biochemischen Assays in vitro zu ersetzen.