Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Stanford University School of Medicine og en Siebel Fellowship tildelt S. C.

1. Stem Cell vedlikehold
Merk: Celle vedlikeholds protokollen som er beskrevet nedenfor, gjelder for pluipotent stamceller (PSCer) som vedlikeholdes i en tilhenger monolag. Media, andre reagenser og cellekultur plater som brukes før DMSO-behandling kan justeres etter behov. For alle følgende protokoller i dette manuskriptet, bør celler håndteres under et biologisk sikkerhetskabinett.
<ol><li>Coat sterile, 6 brønn, vev kultur-behandlet plater med en pluripotent stilk cellen kvalifisert matrise eller substrat fremstilt i henhold til produsentens anvisninger og ruge i minst 1 time i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære). Belagt plater kan være film innpakket og lagret ved 4 ° c i opptil en uke.</li>
	<li>Tin embryo PSCer i et vannbad på 37 ° c. Sterilisere hetteglass med etanol før innføring i den biologiske sikkerhetskabinett, deretter umiddelbart overføre cellene ved pipettering til et sterilt konisk rør som inneholder 5-10 volumer av prewarmed stilk cellen Media.</li>
	<li>Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirer mediene og forsiktig resuspend celle pellet i 1 mL Stamcelle Media supplert med en 10 μM ROCK inhibitor, slik som Y-27632.</li>
	<li>Aspirer kulturen matrise fra platen og frø cellene i ønsket tetthet, vanligvis 0,5-1 x 106 celler per brønn i minst 2 ml Stamcelle Media per brønn. Merk: Plating tettheten kan variere på tvers av ulike cellelinjer, og kloner og bør optimaliseres tilsvarende.</li>
	<li>Oppretthold cellene ved å erstatte med prewarmed Stamcelle medier daglig. Del cellene med omtrent 70%-80% confluency, eller når celle koloniene begynner å ta kontakt.</li>
	<li>For å splitte celler, aspirer mediene og vask cellene en gang med steril PBS. Ruge cellene med 1 mL dissosiasjon enzym løsning per brønn i 5-10 minutter ved 37 ° c.</li>
	<li>Vask og resuspend cellene med prewarmed stilk cellen Media og overføre til en steril konisk rør med 5-10 volumer av stilk cellen Media. Følg trinn 1.3-1.7 for å plate cellene.</li>
</ol>2. DMSO-forbehandling
Merk: Når plating cellene for DMSO-forbehandling før differensiering, den starter plating celle tetthet bør optimaliseres med hensyn til den typiske vekstraten av stilk cellen linje samt differensiering protokollen som brukes. Valider pluripotency ved hjelp av konvensjonelle markører etter behov. Celler skal passert minst 1x-2x etter første tine før differensiering.
<ol><li>
2D kultur differensiering
	<ol>
<li>Når cellene når en passende confluency, klargjør du belagte plater, distansere cellene og klargjør en enkelt celle suspensjon som beskrevet ovenfor.</li>
		<li>Tell de aktive cellene ved hjelp av en hemocytometer eller automatisk celle teller, inkludert trypan blå eller en annen levedyktighet markør.</li>
		<li>Plate cellene på en belagt 6 brønn plate på 0,5-1 x 106 celler per brønn i Stamcelle Media med 10 μM rock inhibitor. Merk: For cellelinjene testet i laboratoriet vårt, resulterte disse tettheten vanligvis i 80%-90% confluent celler innenfor 24 h DMSO-forbehandling.</li>
		<li>Tillat at celler ruge i 24 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære).</li>
		<li>Forbered 1%-2% DMSO i prewarmed Stamcelle Media (f. eks, 100 μL av DMSO i 10 mL av Media = 1% DMSO-løsning, eller 200 μL DMSO i 10 mL av Media = 2% DMSO-løsning).</li>
		<li>Etter 24 h inkubasjons, aspirer mediene fra celler og erstatte den med DMSO-løsning.</li>
		<li>La cellene ruge i 24 timer til 48 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære) før differensiering. Merk: Vanligvis er en 24 h DMSO-behandling tilstrekkelig over et flertall av menneskelig ESC og iPSC linjer. Cell linjer med svært langsom vekstrater (lang dobling ganger) kan dra nytte av 48 h inkubasjons med DMSO. For en 48 h inkubasjons med DMSO, kan Media bli erstattet med fersk stilk cellen Media med 1%-2% DMSO etter første 24 h av behandlingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D-kultur differensiering:
	<ol>
<li>Når cellene nå en passende confluency, distansere og samle cellene i en celle suspensjon som beskrevet ovenfor.</li>
		<li>Telle levende celler ved hjelp av en hemocytometer eller automatisk celle teller inkludert en levedyktighet markør.</li>
		<li>Plate cellene i en ubehandlede, lav-vedlegg 6 brønn plate på 0,5-1 x 106 celler per brønn i Stamcelle Media med 10 μM rock inhibitor. Merk: For cellelinjer testet i vårt laboratorium, disse tettheten vanligvis resulterte i 3D hPSC sfære formasjon innen 24 h av innstillingen celler.</li>
		<li>Tillat at celler ruge i 24 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære).</li>
		<li>Forbered 1%-2% DMSO i prewarmed Stamcelle Media (f. eks, 100 μL av DMSO i 10 mL Media = 1% DMSO-løsning, eller 200 μL av DMSO i 10 mL av Media = 2% DMSO-løsning).</li>
		<li>Bytt ut Media følgende standard prosedyrer (for eksempel vippe platen i en 30 °-45 ° vinkel for å tillate celle kuler til å bosette seg på bunnen av brønnen; overføre celler til et sterilt konisk rør og la celle kuler bosette seg på bunnen av røret; eller forsiktig samle celler i n suspensjon ved hjelp av en 5 eller 10 mL pipette i et sterilt konisk rør og sentrifuger celler ved 300 x g i 5 min ved RT).</li>
		<li>Aspirer mediene fra celler og erstatte den med DMSO-løsning, pipettering forsiktig.</li>
		<li>La cellene ruge i 24 timer til 48 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære) før differensiering. Merk: Vanligvis er en 24 h DMSO-behandling tilstrekkelig over et flertall av menneskelig ESC og iPSC linjer. Cell linjer med svært langsom vekstrater (lang dobling ganger) kan dra nytte av 48 h inkubasjons med DMSO. For en 48 h inkubasjons med DMSO, kan Media bli erstattet med fersk stilk cellen Media med 1%-2% DMSO etter første 24 h av behandlingen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. differensiering til primær bakterie lag
Merk: Følgende beskriver metoder som tidligere vist å være effektive i vårt laboratorium for PSCer vokst i en monolag på 6 brønn plater. Eventuelle differensiering protokoll av valget bør brukes etter DMSO-behandling for å fremme differensiering i ønsket linjene. Fjern DMSO-løsningen etter en 24-48 h behandling og fortsette med differensiering følgende standardprotokoller.
<ol><li>
Endoderm differensiering (tilpasset fra Kroon et al.30)<ol>
<li>Forbehandle celler med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D kulturer.</li>
		<li>Forbered Wnt3a og Activin A lager løsninger.</li>
		<li>Forbered dag 1 endodermal differensiering Media ved å legge Wnt3a til en endelig konsentrasjon av 20 ng/mL og Activin A til en endelig konsentrasjon av 100 ng/mL til riktig volum av prewarmed RPMI Media.</li>
		<li>Etter DMSO forbehandling, aspirer medier fra cellene og erstatte den med dag 1 Media (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate).</li>
		<li>Tillat at celler ruge i 24 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære).</li>
		<li>Forbered dager 2 og 3 endodermal differensiering Media ved å legge Activin A til en endelig konsentrasjon av 100 ng/mL til riktig volum av prewarmed RPMI Media.</li>
		<li>Aspirer Media fra cellene og erstatte den med dag 2 medier (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate).</li>
		<li>La cellene ruge i 24 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære).</li>
		<li>Aspirer Media fra cellene og erstatte med dag 3 medier (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesoderm differensiering (tilpasset fra Zhang et al.31)<ol>
<li>Forbehandle cellene med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D kulturer.</li>
		<li>Forbered Wnt3a og Activin A lager løsninger.</li>
		<li>Forbered mesodermal differensiering Media ved å legge Wnt3a til en endelig konsentrasjon på 20 ng/mL og Activin A til en endelig konsentrasjon av 100 ng/mL til riktig volum av prewarmed avanserte RPMI medier.</li>
		<li>Etter DMSO forbehandling, aspirer medier fra celler og erstatte med differensiering Media (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate).</li>
		<li>Tillat at celler ruge i 24 timer ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ektoderm differensiering (tilpasset fra Chambers et al.32)<ol>
<li>Forbehandle cellene med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D kulturer.</li>
		<li>Forbered noggin og SB431542 lager løsninger.</li>
		<li>Forbered ectodermal differensiering Base media ved å oppløse knockout serum erstatning (KOSR) til en endelig konsentrasjon på 10% i knockout DMEM. Merk: Forbered nok Base media for 3-4 dager med Media endring.</li>
		<li>Forbered ectodermal differensiering Media ved å legge noggin til en endelig konsentrasjon av 500 ng/mL og SB431542 til en endelig konsentrasjon på 10 μM til riktig volum av prewarmed KOSR/knockout DMEM.</li>
		<li>Etter DMSO forbehandling, aspirer medier fra celler og erstatte med differensiering Media (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate).</li>
		<li>Tillat at celler ruge for 3-4 dager ved 37 ° c i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære), erstatte Media daglig med nylig lagt differensiering faktorer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. differensiering til Stamcelle typer
Følgende beskriver metoder som tidligere vist å være effektive i vårt laboratorium for PSCer vokst i en 2D eller 3D kulturer. Eventuelle differensiering protokoll av valget bør brukes etter DMSO-behandling for å fremme differensiering i ønsket linjene. Fjern DMSO-løsningen etter en 24-48 h behandling og fortsette med differensiering følgende standardprotokoller.
<ol><li>Nevrale Stamcelle differensiering (tilpasset fra Tchieu et al.33)<ol>
<li>Forbered 6 brønn plater ved belegg med en pluripotent stilk cellen kvalifisert redusert vekstfaktor matrise eller substrat, per produsentens instruksjoner, for minst 1 t i en CO2 inkubator (5% co2, fuktig atmosfære). Belagte plater kan pakkes sammen og oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 uke.</li>
		<li>Plate PSCer som beskrevet ovenfor ved tetthet på 0,5-1 x 106 celler per brønn i Stamcelle medier som inneholder en rock-hemmer.</li>
		<li>Forbehandle celler med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D kulturer.</li>
		<li>Forbered små kjemiske hemmere LDN193189, SB431542, og XAV939 lager løsninger.</li>
		<li>Forbered dager 1-3 neuroectoderm differensiering Media ved å supplere Essential 6 Media med 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542 og 2 μM XAV939.</li>
		<li>Etter DMSO forbehandling, aspirer Media og erstatte med Days 1-3 neuroectoderm Media (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate). Endre Media daglig.</li>
		<li>Forbered dager 4-12 neuroectoderm differensiering Media ved å supplere Essential 6 Media med 500 nM LDN193189 og 10 μM SB431542.</li>
		<li>På dag 4 av differensiering, aspirer Media og erstatte med Days 4-12 neurodectoderm Media. Endre mediene daglig.</li>
		<li>Etter 12 dager med differensiering, bør differensiert celler uttrykke hensiktsmessig markører for nevrale stamceller (NPCer). NPCer kan videre opprettholdes i nevrale medier som inneholder DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2, og supplert med 10 μg/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF). Passage NPCer når confluent ved hjelp av en celle avløsning løsning, plating NPCer på 0,5-1 x 106 celler per brønn.</li>
	</ol></li>
	<li>Oligodendrocyte Stamcelle differensiering (tilpasset fra Douvaras og Fossati34)<ol>
<li>Plate PSCer som beskrevet ovenfor ved en tetthet på 1 x 105 per brønn på belagt 6 brønn plater i Stamcelle medier inneholder en rock inhibitor.</li>
		<li>Forbehandle celler med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D kulturer.</li>
		<li>Forbered SB431542, LDN193189, all-trans retinoic acid (RA), og glattes Agonistiske (SAG) lager løsninger.</li>
		<li>Forbered dag 0 – 8 differensiering Media ved å supplere DMEM/F-12 med 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189, og 100 nM RA.</li>
		<li>Etter DMSO forbehandling, ruge celler med differensiering Media for 8 dager, skiftende medier daglig med fersk lagt differensiering faktorer (f. eks, 2 mL per brønn av en 6 brønn plate).</li>
		<li>På dag 8, erstatte Media med DMEM/F-12 inneholder 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) løsning 1X L-glutamin, 2-mercaptoethanol, penicillin/Streptomycin, og 1x N-2 supplert 100 nM RA og 1 μM SAG. Endre mediene daglig.</li>
		<li>Etter 12 dager med differensiering, bør differensiert celler uttrykke hensiktsmessig markører for oligodendrocyte stamceller (OPCs).</li>
	</ol></li>
	<li>Endokrine stamfar celle differensiering (tilpasset fra Pagliuca et al.35)<ol>
<li>Seed PSCer ved 6 x 105 celler/ml i Stamcelle Media pluss 10 μM rock inhibitor i 500 ml spinner flasker plassert på en 9-posisjon rør plate satt til rotasjonshastighet på 70 RPM i en 37 ° c inkubator, 5% co2, og 100% luftfuktighet.</li>
		<li>Tillat klynger å bosette seg på bunnen av flasken, aspirer Media, deretter forbehandle med 1%-2% DMSO.</li>
		<li>Forbered Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, all-trans retinoic acid (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, og Betacelluin lager løsninger.</li>
		<li>Forbered differensiering Base media basert på formulering i tabell 3.</li>
		<li>Etter DMSO forbehandling, aspirer Media og erstatte med S1 Media supplert med 100 ng/mL Activin A og 3 mM Chir99021 (f. eks, 500 mL per kolbe). Tillat inkubasjons for 24 h.</li>
		<li>På dag 2, Bytt ut Media med S1-medium supplert med 100 ng/mL Activin A. Tillat inkubasjons i 2 dager.</li>
		<li>På dag 4, Erstatt Media med S2 Media supplert med 50 ng/mL KGF. Tillat inkubasjons for 3 dager, skiftende medier etter de første 2 dager (dag 6).</li>
		<li>På dag 7, Erstatt Media med S3 Media supplert med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA og 200 nM LDN193189. Tillat inkubasjons for 24 h.</li>
		<li>På dag 8, Erstatt Media med S3 Media supplert med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189, og 500 nM PdBU. Tillat inkubasjons for 24 h.</li>
		<li>På dag 9, Erstatt Media med S3 Media supplert med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, og 100 nM RA. Tillat inkubasjons i 5 dager, skiftende medier hver 2 dager (dag 11 og 13).</li>
		<li>På dager 14 og 16, erstatte medier med S5 Media supplert med 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3, og 20 ng/mL betacellulin (4 dager totalt inkubasjons).</li>
		<li>På dager 18 og 20, erstatte Media med S5 Media supplert med 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3, og 20 ng/mL betacellulin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Immunocytochemical validering av differensiering
Merk: Følgende metoder beskriver en generell immunocytochemical protokoll som kan justeres etter behov. Primære antistoffer er de som tidligere har blitt validert i laboratoriet vårt. Andre teknikker for validering av differensiering kan også brukes (f. eks flyt flowcytometri, qPCR, RNA sekvensering, Western blotting, funksjonelle analyser, etc.).
<ol><li>
Immunolabeling celler
	<ol>
<li>For 3D-kulturer i suspensjon, plate hele celle klynger eller klynger spres til enkelt celle fjæring på belagte plater for 18-24 h før fiksering.</li>
		<li>Aspirer medier fra tilhenger celler og vask kort med PBS på RT på en shaker.</li>
		<li>For celle fiksering, aspirer PBS og ruge celler med 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS for 20 min på RT på shaker. Forsiktig: PFA lager skal være forberedt under en avtrekks hette på grunn av sin toksisitet. Ikke pust inn og bruk egnet personlig verneutstyr.</li>
		<li>Fjern PFA og kast den i riktig kjemisk avfallsbeholder.</li>
		<li>Vask cellene 3x med PBS i minst 5 min per vask på RT på en shaker.</li>
		<li>For celle permeabilization og blokkering, ruge celler med 5% esel serum fremstilt i 0,3% Triton-x 100/PBS for 1 time på RT på en shaker.</li>
		<li>Forbered primær antistoff løsning i den samme løsningen som brukes for permeabilization/blokkering.</li>
		<li>Ruge i primær antistoff løsning over natten ved 4 ° c på shaker.</li>
		<li>Etter over natten inkubasjons, vaske celler 3x med PBS i minst 5 min per vask på RT på en shaker.</li>
		<li>Forbered sekundær antistoff løsning i permeabilization/blokkerings løsning.</li>
		<li>La det ruge i sekundær antistoff løsning for 1 time ved RT på en shaker.</li>
		<li>Aspirer sekundære antistoff løsning og vaske celler 3x med PBS i minst 5 min per vask på RT på en shaker.</li>
		<li>Ruge celler med DAPI eller en annen foretrukket markør for passende inkubasjonstid, og skyll i PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bilde kvantifisering
	<ol>
<li>Tilegne seg minimum tre bilder per tilstand på et fluorescerende mikroskop og/eller med et høyt innhold screening plattform.</li>
		<li>Kvantifisere prosent av positive celler for hver markør ved å telle det totale antall antistoff fargede celler og totale celle tall (basert på DAPI/Hoechst kjerner farging) ved hjelp av objektiv bildebehandling programvare (f. eks ImageJ) eller en automatisert screening plattform for Analyser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Oppsummert denne protokollen beskriver en enkel og rimelig verktøy for å forbedre differensiering kapasitet på Pluripotent stamceller (PSCer) til alle primære bakterie lag, ulike typer spesialiserte stamceller, og selv funksjonelle, modne celletyper i in vitro og in vivo-innstillinger. Illustrert er spesifikke differensiering protokoller som har blitt effektivt gjengis i vårt laboratorium så vel som andre, men eventuelle differensiering protokoll av valget kan brukes etter DMSO-behandling. Som vist i tabell 1, har en rekke laboratorier også vist en forbedring av PSC differensiering etter forbigående DMSO-behandling ved hjelp av ulike paradigmer å generere ulike andre Terminal celletyper. Videre, selv om metodene her beskriver bruken av menneskelige PSCer, DMSO-forbehandling kan benyttes på tvers av arter og har vist å være effektive i mus, kanin, og primater PSCer.
Selv om høyere doser av DMSO er kjent for å være cytotoksisk, de lave dosene som brukes i denne metoden (1%-2%) for en forbigående periode resultere i minimal celle død. Mens samlede celle tall umiddelbart etter DMSO-behandling kan redusere på grunn av DMSO fremme celle syklus arrest i G1 fasen av celle syklus, tidligere studier viser at cellene er i stand til å nå samme nivå av confluency som kontroll kulturer etter fjerning av DMSO3.
Prosent og varighet av DMSO-forbehandling bør optimaliseres per cellelinje. Behandlingstiden bør justeres med hensyn til sykling/dobling tid av cellene. For eksempel, mus PSCer vanligvis har mye kortere syklustider på ca 15 h; dermed DMSO behandling for 15 t for disse cellene er tilstrekkelig. Noen laboratorier har også funnet DMSO-behandling for å være gunstig når du fortsetter under differensiering protokollen eller ved lavere konsentrasjoner (se tabell 1). Det bør bemerkes at noen PSC-linjer er mer amendable å differensiering til bestemte linjene. For eksempel har HUES6 celler vist å være mindre ettergivende til differensiering og dermed hadde markert bedring med DMSO-behandling (figur 2). Alternativt, HUES8 celler som brukes i Figur 4 og figur 5 har vist å ha en høyere tilbøyelighet mot endodermal differensiering; Dermed ble færre forskjeller vist mellom kontroll og DMSO for differensiering ved de innledende stadier mot definitive endoderm. Likevel er forbedringen av DMSO-forbehandling observert i senere stadier av differensiering i denne cellelinjen (Figur 4B). DMSO-behandling er også allsidig ved at den er effektiv i både 2D og 3D cellekulturer systemer, den kan brukes med ulike typer belegg materiale på cellekultur plater, og det fungerer i ulike typer vedlikehold medium som fremmer vekst og utvidelse av hPSCs (f. eks, mTeSR, E8, MEF conditioned Media, etc).
Mer generelt, disse resultatene tyder på at start tilstanden av Pluripotent stamceller har en sterk innflytelse på tilbøyelighet for første differensiering samt Terminal differensiering inn funksjonell celletyper. Vi har tidligere vist at DMSO-behandlingen fungerer gjennom RB i hPSCs. RB spiller en viktig rolle i å fremme Terminal differensiering, celle overlevelse, og den genetiske stabiliteten i cellene41,42,43,44, og det kan derfor forklare vedvarende effekter på celler differensiert fra DMSO-behandlet hPSCs. Målretting disse tidlige moduser av regulering kan plassere hPSCs på en bedre bane for differensiering og til slutt forbedre sine verktøy for regenererende medisin.

Bruken av Pluripotent stamceller har ført til en rekke fremskritt innen biomedisinsk forskning, inkludert felt av regenererende medisin og Stamcelle BAS ert behandling, sykdoms modellering og narkotika screening. Det har også ført til den generelle utsiktene til mer oversettbare forskning og personlig medisin. Ankomsten av indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) teknologi over 20 år siden har tillatt forskere å utvikle Pluripotent stamceller fra somatiske vev og differensiere dem til funksjonell celletyper for å studere en rekke patologi, inkludert kardiovaskulære, nevrologiske, og immunologiske sykdommer. Selv om betydelige fremskritt er gjort i Stamcelle differensiering teknologi, utfordringer i effektivt å skille menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og iPSCs fortsatt vedvarer, begrenser utbredt bruk av stamcelleteknologi på tvers av ulike forskningsprogrammer. Iboende variasjon på tvers av ulike cellelinjer og kloner fortsetter å utgjøre hindringer for å skille stilk cellen linjer til ønsket linages1. Videre, avledet modne, er uhelbredelig differensiert funksjonelle celler fra hPSCs fortsatt en kjedelig og ineffektiv prosess på tvers av mange linjene. Faktisk, celler differensiert fra hPSCs ofte ikke til døds å differensiere til funksjonelle celler2. I ytterligere bevegelige stilk cellen-basert behandling til bruk hos pasienter, er det behov for å forbedre og sikre effekten av celler som er generert fra hPSCs.
Vår Lab har etablert et raskt og rimelig verktøy for å betydelig øke effektiviteten av å skille både iPSCs og ESCs i modne celletyper. Vi fant at forbehandling av hiPSCs og hESCs med den brukte reagens dimethyl sulfoxide (DMSO) for 24 h til 48 h før rettet differensiering resulterer i en markert forbedring i Stamcelle differensiering kapasitet. Behandling med DMSO øker andelen av hiPSCs og hESCs i begynnelsen av G1 fasen av cellesyklusen og aktiverer retinoblastoma protein (RB)3, en kritisk regulator av celle spredning, overlevelse, og differensiering4. I nyere arbeid, har det blitt funnet at RB og deres familiemedlemmer er nødvendig for den Pro-differensiering effekter av DMSO, slik at forbigående deaktivering av RB undertrykker virkningene av DMSO, mens konstituerende aktivering av RB i en forbigående måte forbedrer DMSO ' s effekter5. Analogt til celle syklus under embryonale utviklingen, celle syklus av ESCs og iPSCs er preget av en forkortet G1 fase som fremmer selv-fornyelse6,7,8. Denne forkortede G1-fasen tillater mer ubegrenset spredning, men begrenser potensialet for differensiering4,9. Ved å fremme vekst arrest i G1 og aktivere kontrollpunkt kontroller i celle syklus av hESCs og iPSCs, DMSO-behandling primtall celler for celle skjebne endringer etter rettet differensiering.
Hittil har DMSO forbehandling vist seg å forbedre differensiering kapasitet til alle tre bakterie lag i over 30 kontroll og sykdom-spesifikke menneskelige ESC og IPSC cellelinjer3,5 samt differensiering av stamceller og andre cellelinjer til en rekke andre modne celletyper i senere studier10,11,12,13,14,15,16, 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 (tabell 1). Videre har DMSO-behandling vist å være effektiv i å øke differensiering av ikke-menneskelige primære celler21,23 (f. eks, mus, primater, kanin), antyder delte mekanismer på tvers av arter. Endelig, DMSO forbehandling har også blitt utvidet til genredigering teknologi, med en bestemt studie som viser at 24 h DMSO forbehandling av hESCs/iPSCs betydelig økt evne til gruppert regelmessig oppdelt kort Palindromic gjentar (CRISPR) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-mediert redigering effektivitet av ikke-koding DNA uten å innlemme utilsiktede mutasjoner29. Forutsatt her er en detaljert metodikk av DMSO-forbehandling av hESCs og iPSCs for anvendelser i Stamcelle biologi og rettet differensiering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Til tross for den økende bruken av Pluripotent stamceller (PSCer), utfordringer i effektivt å skille embryonale og induserte Pluripotent stamceller (ESCs og iPSCs) på tvers av ulike linjene forbli. Tallrike differensiering protokoller har blitt utviklet, men variasjon på tvers av cellelinjer og lave utbredelsen av differensiering formidle utfordringer i vellykket gjennomføring av disse protokollene. Beskrevet her er en enkel og rimelig måte å forbedre differensiering kapasitet på PSCer. Det har tidligere blitt vist at behandling av stamceller med en lav konsentrasjon av dimethyl sulfoxide (DMSO) øker tilbøyelighet av en rekke PSCer å differensiere til ulike celletyper etter rettet differensiering. Denne teknikken har nå vist seg å være effektiv på tvers av ulike arter (f. eks, mus, primater, og menneske) i flere linjene, alt fra neurons og kortikale spheroids til glatte muskelceller og hepatocytter. DMSO-forbehandling forbedrer PSC differensiering ved å regulere celle syklus og grunning stamceller til å være mer mottakelig for differensiering signaler. Forutsatt her er den detaljerte metodikk for å bruke dette enkle verktøyet som reproduserbar og allment aktuelt middel til mer effektivt å skille PSCer til enhver slektslinje av valget.

Morfologi av DMSO behandlet iPSCs Human iPSCs avledet fra kontroll var kultivert enten i en tilhenger 2D monolag eller i 3D celle kuler i suspensjon. Omtrent 24 timer etter første plating, celler ble behandlet med enten 1% eller 2% DMSO for 24 h i vedlikehold medium. Representative brightfield bilder etter DMSO-behandling er vist i figur 1. I samsvar med tidligere rapporter for iPSCs vedlikeholdes i en monolag3, DMSO forbehandling resulterte i en forbigående dose avhengig reduksjon i vekst i forhold til ikke-DMSO behandlet celler (figur 1a). Denne reduserte spredningen er forbundet med en økning i celle-til-celle-kontakt, noe som er spesielt uttalt i 2% DMSO-behandlede celler som viser økt dannelse av mer svært gruppert celle kolonier. I andre celletyper, DMSO-indusert G1 arrest har vist seg å være assosiert med økt uttrykk for proteiner involvert i celle-celle interaksjoner som støtter kontakt-hemming indusert vekst arrest36. I iPSCs opprettholdt som 3D celle kuler, DMSO behandling tilsvarende økt antall celle kuler (figur 1B). Videre, DMSO-behandling resulterte også i mindre variabel 3D sfære størrelser, som tidligere har vist å være en indikasjon på forbedret differensiering kapasitet av cellene37. Viktig, verken 1% eller 2% DMSO resulterte i celle toksisitet, målt ved levedyktighet teller (n = 3; 2D kultur% Live = kontroll: 80 ± 1,3; 1% DMSO: 82 ± 3,7, 2%: 81 ± 2,7; 3D kultur% Live = kontroll: 81 ± 4,3; 1% DMSO: 82 ± 6,7, 2%: 82 ± 2,7). Samlet sett er disse resultatene i samsvar med forestillingen om at DMSO-behandling endrer celle syklus og vekst mønstre i kulturperler stamceller. Disse effektene på veksthemming er reversibel når DMSO er fjernet fra mediet, som tidligere vist3.
DMSO-behandling forbedrer differensiering av ESCs til den primære bakterie lag HUES6 hESCs ble sådd på belagt plater for 24 h etterfulgt av behandling med 2% DMSO for 24 h i vedlikehold medium. Celler ble deretter differensiert inn i de tre primære bakterie lag etter behandling paradigmer vist i figur 2A30,31,32. Differensiert celler ble deretter fast og immunologisk beiset for prototypic markører for hver respektive bakterie lag (SOX17 for endoderm, brachyury for mesoderm, og SOX1 for ektoderm). Som vist i figur 2B, økte 24 h av FORBEHANDLING med 2% DMSO andelen av celler som uttrykker hver respektive bakterie lag markør. Dette er forenlig med tidligere rapporter fra laboratoriet vårt viser økt immunoreactivity, genuttrykk, samt absolutte antall differensiert celler mot alle bakterie lag i stamceller behandlet med DMSO3,5. HUES6 er en hESC linje med svært lav tilbøyelighet for differensiering på tvers av alle linjene1, men DMSO-behandlingen vesentlig forbedrer sin kapasitet til å skille på tvers av alle bakterie lag.
DMSO-behandling forbedrer differensiering til Stamcelle typer For å undersøke effekten av DMSO på differensiering til CNS Stamcelle typer, menneskelige iPSCs var differensiert til enten nevrale stamceller (NPCer) eller oligodendrocyte stamceller (OPCs). Å generere NPCer, celler ble forbehandlet med 2% DMSO for 24 h i vedlikehold medium etterfulgt av 12 dager med regissert differensiering33 (Figur 3A). Som vist i Figur 3B, 2% DMSO FORBEHANDLING økt UTTRYKKET av NPC markør PAX6 i forhold til kontroll. Ved hjelp av en annen tidligere validert protokoll34 (Figur 3C) ble iPSCs differensiert i 12 dager til OPCs. I likhet med NPCer, OPCs avledet fra iPSCs forbehandlet med 2% DMSO for 24 h demonstrert en økning andel av celler som uttrykker OPC markører OLIG2 (Figur 3D).
En første DMSO-behandling vedvarer for å forbedre differensiering i modne celletyper For å undersøke effekten av DMSO på siste stadier av en differensiering protokollen, HUES8 hESCs var forbehandlet for 24 h med 2% DMSO før differensiering til β-celler etter en 20 dagers rettet differensiering protokollen beskrevet i Figur 4a 35. HUES8 ble brukt som de har vært tidligere vist å ha en høyere tilbøyelighet mot endodermal avstamning1,38. På bestemt endoderm stadiet, de differensiert cellene uttrykker SOX17 og FOXA2, definitive endoderm (DE) spesifikke markører. Med ytterligere differensiering i bukspyttkjertelen forfedre (PP1) scenen, differensiert celler uttrykker PDX1 og FOXA2, markører karakteristisk for bukspyttkjertelen stamceller. På disse stadier av bukspyttkjertelen celle differensiering, effektiviteten av induksjon i DE og senere i PP1 var høy for både kontroll og DMSO-behandlet hESCs differensiert i hver av disse stadiene (Figur 4B, trinn 1 og 3). selv om HUES8 cellelinjen har blitt bemerket å ha økt tilbøyelighet til å differensiere til endodermal avstamning, som differensiering er indusert videre inn i mer spesialiserte celletyper på terminalen stadier av DMSO-behandlet hESCs er mye mer sannsynlig å produsere modne bukspyttkjertelen endokrine celler. Effektiviteten av generere PDX1/NKX 6.1 + bukspyttkjertelen stamceller, Neurogenin 3 + endokrine celler, og NKX 6.1/C-peptid + SC-β celler var vesentlig høyere i DMSO-behandlet hESCs (Figur 4B, trinn 4 og 5). Disse resultatene er i tråd med NPC og OPC differensiering viser at DMSO forbedrer differensiering potensialet til Stamcelle typer og viser også at effekten av DMSO er vedvarende generere mer spesialiserte celletyper. Dette er i samsvar med tidligere arbeid, der vi har vist at den innledende 24 h DMSO behandling øker differensiering i Terminal Cell typer på tvers av bakterie lag, inkludert i neuronal celler samt slo cardiomyocytes31,39 i cellelinjer med høy eller dårlig propensities for differensiering3.
Initial DMSO-behandling forbedrer hESC-avledet celle funksjon etter in vivo transplantasjon Tidligere har vi vist effektiviteten av DMSO-behandling i å øke differensiering av hESCs i funksjonell bukspyttkjertelen stamceller som senere viser en markert forbedring i insulin sekresjon i vivo3. Ved hjelp av tidligere utgitte protokoller3,30,40, HUES8 hESCs ble behandlet med 1% DMSO for 24 h, differensiert i bukspyttkjertelen stamceller, og transplantert inn immunodeficient SCID-beige mus for å vurdere funksjonalitet (f.eks. insulin sekresjon som reaksjon på en glukose utfordring eller KCl stimulering) (figur 5a). Mens effektiviteten av differensiering inn FOXA2 + (~ 90%) og PDX1 + (~ 75%) bukspyttkjertelen forfedre var sammenlignbare mellom kontroll og DMSO-behandlet hESCs (figur 5B) for HUES8 hESC linje, cellene differensiert fra hESCs etter en 24 h 1% DMSO-behandling hadde forbedret respons til glukose og KCl stimulering etter in vivo-transplantasjon. Forbedringer i funksjonaliteten var tydelig innen 2 uker etter transplantasjon (figur 5C) og opprettholdt opp til minst 16 uker etter transplantasjon (figur 5D). Til sammen, disse resultatene tyder på at DMSO forbehandling ikke bare øker differensiering effektivitet til bakterie lag, stamceller, og mer modne celletyper, men også at det vedvarer for å forbedre funksjonaliteten til differensiert celler i vivo.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Differensiert celle type</td>
			<td>Start celle type</td>
			<td>% DMSO</td>
			<td>Lengde på DMSO-behandling</td>
			<td>Lengde på DMSO-behandling</td>
		</tr>
<tr>
<td>Leverceller</td>
			<td>Esc Hepatosarkom cellelinje Esc Esc Mesenchymal stamceller iPSCs Esc Esc Hepatosarkom cellelinje Esc</td>
			<td>1,0 1,0 1,0 0,5 0.1-2.0 1,0 1,0 0,5 1,0 0,6</td>
			<td>8 dager Flere dager 7 dager 10-14 dager 7-21 dager 7 dager 4 dager 5 dager 2-21 dager Gjennom</td>
			<td>Basma et al., 2008 Kanebratt og Andersson, 2008 Hay et al., 2009 Duan et al., 2010 Alizadeh et al., 2014 Kondo et al., 2014 Szkolnicka et al., 2014 Czysz et al., 2015 Nikolaou et al., 2016 Vanhove et al., 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primære bakterie lag</td>
			<td>ESCs og iPSCs hESC hESC</td>
			<td>0.1-2.0 0,5 0.1-2.0</td>
			<td>24 timer 24 timer 24 timer</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015 Li et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>CARDIAC celler</td>
			<td>ESCs og iPSCs P19 celler ESCs og iPSCs Fosterets Mesenchymal stamceller</td>
			<td>0.1-2.0 1,0 1.0-2.0 0.8-1.0</td>
			<td>24 timer 4 dager 24-30 timer 24 timer</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Choi et al., 2014 Van den Berg et al., 2016 Deng et al., 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bukspyttkjertelen celler</td>
			<td>ESCs og iPSCs hESC</td>
			<td>0.1-2.0 0,5</td>
			<td>24 timer 24 timer</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glatte muskelceller</td>
			<td>P19 celler</td>
			<td>1,0</td>
			<td>4 dager</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endothelial celler</td>
			<td>P19 celler</td>
			<td>1,0</td>
			<td>4 dager</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enterocytes</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1,6</td>
			<td>4 dager</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tarm epitel</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1,6</td>
			<td>4 dager</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nevrale celler</td>
			<td>Marmoset iPSC</td>
			<td>0,05-2.0</td>
			<td>24 timer</td>
			<td>Qiu et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nøytrofile</td>
			<td>Leukemi cellelinje</td>
			<td>1,25</td>
			<td>6-8 dager</td>
			<td>Teimourian og Moghanloo, 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skjelett Myotubes</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>1,5</td>
			<td>24 timer</td>
			<td>Swartz et al., 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kortikale organoid</td>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>1,0</td>
			<td>24 timer</td>
			<td>Yoon et al., 2018</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammendrag av tidligere publisert arbeid demonstrere gunstige effekter av DMSO behandling på differensiering.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1</td>
			<td>S2</td>
			<td>S3</td>
			<td>S5</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCDB131 (L)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose (g)</td>
			<td>0,44</td>
			<td>0,44</td>
			<td>0,44</td>
			<td>3,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (g)</td>
			<td>2,46</td>
			<td>1,23</td>
			<td>1,23</td>
			<td>1,754</td>
		</tr>
<tr>
<td>FAF-BSA (g)</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X (mL)</td>
			<td>0,02</td>
			<td>0,02</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutamax (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamin C (mg)</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin (mg)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>P/S (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: komponenter i endokrine stamfar celle differensiering base medier.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig1.jpg"> Figur 1 : DMSO-behandling endrer veksten av hPSCs. (A) representative brightfield bilder av hiPSCs belagt i en monolag etter å ha mottatt ingen behandling (kontroll) eller behandling med 1% eller 2% DMSO for 24 h. DMSO fremmer en forbigående dose avhengig veksthemming av iPSCs. (B) representative brightfield bilder av hiPSCs belagt på lav-vedlegg plater for å tillate 3D sfære formasjon etter å ha mottatt ingen behandling (kontroll) eller behandling med 1% eller 2% DMSO for 24 h. DMSO-behandling resulterer i mindre variabel 3D sfære formasjon sammenlignet med kontroll. Scale bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig2.jpg"> Figur 2 : DMSO-behandling forbedrer differensiering av hPSCs til primære bakterie lag. (A) skjematisk av differensiering protokoller som brukes til å generere de tre primære bakterie lag. (B) representative bilder av differensiert HUES6 hESCs-IMMUNOLABELED for SOX17 (endoderm), brachyury (mesoderm) og SOX1 (ektoderm). Forbehandling med 2% DMSO for 24 h økt differensiering effektivitet på tvers av alle tre bakterie lag. Prosenter av celler differensiering inn SOX17 + endodermal, Brachyury (Brachy) + mesodermal, eller SOX1 + ectodermal celler etter rettet differensiering i hver bakterie lag med kontroll og DMSO-behandlet hESCs er notert med SEM av tre biologiske replikerer . Ikke-sammenkoblet t-test: endoderm p = 0,0003; mesoderm p = 0,047; ektoderm p = 0,015. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig3.jpg"> Figur 3 : DMSO-behandling forbedrer differensiering til neural stamfar celletyper. (A) skjematisk av differensiering protokollen brukes til å generere nevrale stamceller (NPCer). (B) representative bilder av menneskelig iPSCs differensiert i NPCer Immunolabeled for Pax6. 24 h av forbehandling med 2% DMSO økt antall PAX6 positive celler. Prosenter av celler som er unike i Pax6 + NPCer etter rettet differensiering av kontroll og DMSO-behandlet menneskelige iPSCs er notert med SEM av tre biologiske replikerer. Ikke-sammenkoblet t-test: p = 0,0225. Scale bar = 200 μm. (C) skjematisk differensiering protokollen brukes til å generere oligodendrocyte stamceller (OPCs). (D) representative bilder av humant iPSCs differensiert i OPCs-IMMUNOLABELED for OPC-markører Olig2. 24 h av forbehandling med 2% DMSO økt uttrykk for både OPC markører i forhold til kontroll. Prosenter av celler differensiering inn Olig2 + OPCs følgende rettet differensiering av kontroll og DMSO-behandlet menneskelige iPSCs er notert med SEM av fire biologiske replikerer. Ikke-sammenkoblet t-test: p = 0,0466. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig4.jpg"> Figur 4 : DMSO-behandling forbedrer Terminal differensiering potensialet i hPSCs. (A) skjematisk av en ~ 20 dag rettet DIFFERENSIERING av HUES8 hESCs i uhelbredelig differensiert bukspyttkjertelen endokrine celler. (B) Immunostaining for indikerte markører på hvert trinn av differensiering etter rettet differensiering av ubehandlede kontroll celler og celler forbehandlet med 2% DMSO for 24 h. Den første DMSO-behandling vedvarer for å øke differensiering i Terminal endokrine celletyper på sistnevnte stadier av rettet differensiering. Prosenter av celler differensiering inn i indikerte markører på hvert trinn i differensiering etter rettet differensiering av kontroll og DMSO-behandlet hESCs er notert med SEM av to til fire biologiske replikerer. Scale bar = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig5.jpg"> Figur 5 : Initial DMSO-behandling av hPSCs forbedrer glukose respons etter transplantasjon av bukspyttkjertelen stamceller in vivo. (A) skjematisk av rettet differensiering (~ 15 dager) av HUES8 hESCs i bukspyttkjertelen stamceller (PP2) etter ingen behandling (kontroll) eller en 24 h 1% DMSO-behandling og påfølgende transplantasjon (5 000 000 celler) i immunodeficient SCID-beige mus. (B) prosentandel av celler som er unike i PDX1 + og FOXA2 + bukspyttkjertelen stamceller følgende in vitro rettet differensiering av kontroll og DMSO-behandlet hESCs umiddelbart før transplantasjon (n = 1). (C) betyr Elisa målinger av humant insulin fra serum av mus etter en lav (2,5 mm) eller høy (15 mm) glukose utfordring eller kalium klorid (KCl) stimulering ved (c) 2 uker og (D) 16 uker etter transplantasjon av bukspyttkjertelen stamceller differensiert fra kontroll og DMSO-behandlet hESCs (feil bars = SEM; n = 3 ved 2 uker og 16 uker for kontroll; n = 2 ved 2 uker og 16 uker for DMSO). Toveis ANOVA: p = 0,0051 for kontroll kontra DMSO ved 2 uker; p = 0,0116 for kontroll kontra DMSO på 16 uker. Musene studert på ulike tidspunkt poeng er forskjellige. Resultatene er tilpasset fra Chetty et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Generere differensiert celletyper fra humant Pluripotent stamceller (hPSCs) har stor terapeutisk løfte, men er fortsatt utfordrende. PSCer viser ofte en iboende manglende evne til å differensiere selv når stimulert med et skikkelig sett med signaler. Beskrevet her er et enkelt verktøy for å forbedre multilinageceller differensiering på tvers av en rekke PSC linjer.

Transient behandling av humant Pluripotent stamceller med DMSO å fremme differensiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Det er en enkel behandling som kan brukes på en hvilken som helst stamcellelinje eller differensieringsprotokoll til prime celler for differensiering. Alt man trenger å gjøre er å legge DMSO på 1-2% i cellekulturvedlikeholdsmediet. Den største fordelen med denne teknikken er det tillater man å betydelig øke differensiering potensialet av pluripotente stamceller i en hvilken som helst avstamning av valget ved å grunne celler for differensiering.DMSO behandling øker sjansen for at cellene vil skille fra pasient-avledede iPSCer, slik at de kan brukes til celleerstatning terapi, sykdom modellering, og narkotika screening. Det kan gi opphav til tidlig regulering som kontrollerer sub-spredning, differensiering og spesifikasjon under embryonisk utvikling. Vi har vist at DMSO-behandlingen forbedrer differensieringen hos nesten 50 humane embryonale og induserte pluripotente stamcellelinjer.Mens andre laboratorier har vist at det er gunstig for stamceller av andre arter, som mus og primat. En dag før differensasjonen ble tatt i bruk, legg dmso til en konsentrasjon på 1 eller 2 % i 24 timer i ditt typiske vedlikeholdsmedium. 24 timer etter DMSO-behandlingen, erstatt medium og fortsett med din vanlige differensieringsprotokoll.Dyrke celler i henhold til manuskriptretninger. Når cellene når en passende samløpet, dissosiere dem og forberede en enkelt celle suspensjon. Telle de levende cellene med et hemocytometer eller automatisk celle teller, ved hjelp av en levedyktighet markør som trypan blå.For å oppnå 80-90% samløpet innen 24-timers DMSO pre-behandling, plate cellene på en belagt seks-brønns plate med en tetthet på 500.000 til 1 million celler per brønn. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator. Deretter aspirerer du mediet og erstatter det med en 1-2% DMSO-løsning.La cellene inkubere i 24-28 timer før differensiering. Hvis du inkuberer i 48 timer, må du erstatte mediet etter 24 timer med fersk DMSO-løsning. For å oppnå 3D-kulturdilatering, vokse og samle cellene i en cellesuspensjon.Tell de levende cellene og plate dem i en ubestrøket, lav-vedlegg seks-brønns plate i stamcellemedier med ROCK-hemmer. Vanligvis vil 3D humane pluripotente stamceller danne innen 24 timer. La cellene inkubere i 24 timer ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator.Forbered 1-2% DMSO i forhåndsoppvarmede stamcellemedier i henhold til manuskriptretninger. For å erstatte mediet etter inkubasjon, vipp platen i en 30 graders til 45 graders vinkel og la cellesfærer bosette seg nederst på brønnen. Aspirer mediet fra cellene og forsiktig re-suspendere dem i DMSO-løsningen.La cellene inkubere i 24-48 timer ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator. Pre-behandle celler med DMSO som beskrevet for 2D kulturer, og forberede noggin og SB431542 lagerløsninger. Forbered nok 10% knockout serum erstatning, eller KOSR, i knockout DMEM for tre til fire dager med medieendring.Forbered ectodermal differensieringsmedier ved å legge til noggin og SB431542 til forhåndsoppvarmet KOSR knockout DMEM som beskrevet i manuskriptet. Etter DMSO pre-behandling, aspirere media fra celler og legge til to milliliter differensieringsmedier til hver brønn. La cellene inkubere i tre til fire dager ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator, og erstatte medier daglig med friske differensieringsfaktorer.DMSO pre-behandling resulterer i en forbigående og doseavhengig reduksjon i cellevekst sammenlignet med ikke-behandlede celler. Denne reduksjonen spredning er forbundet med en økning i celle-til-celle kontakt, som er spesielt uttalt i 2% DMSO-behandlet celler. Når cellene er faste og farget for prototypiske markører for hvert bakterielag, kan det ses at 2% DMSO pre-behandling resulterer i økt andel differensierte bakterielagceller.For eksempel ble SOX17 farget for å visualisere endodermceller. For å undersøke effekten av DMSO på differensiering til sentralnervesystemet stamcelletyper, kan menneskeinduserte pluripotente stamceller differensieres i enten nevrale stamceller eller oligodendrocytt stamceller. Sammenlignet med kontrollceller øker 2% DMSO pre-behandling uttrykket av neural stamcellemarkør Pax6.På samme måte øker forbehandlingen andelen celler som uttrykker oligodendrocytt stamcellemarkør Olig2. Videre forbedrer den første DMSO-behandlingen human embryonal stamcelleavledet cellefunksjon etter in-vivotransplantasjon. Når differensierte stamceller i bukspyttkjertelen transplanteres til immunsviktede mus, kan funksjonaliteten testes som svar på en glukoseutfordring eller KCl-stimulering.Forbedringer i cellefunksjonalitet er tydelig fra to uker til 16 uker etter transplantasjon. Det viktigste hensynet å ta hensyn til er sykling eller dobling tid av stamceller. Lengden på DMSO-behandlingen bør være den samme som sykkeltiden til cellene.Etter den første DMSO-behandlingen kan man forstå hvordan cellespredning og cellesyklusen reguleres i stamceller, da behandlingen bidrar til å fremme vekstarrest i G1-fasen av cellesyklusen. De differensierte cellene kan brukes til å forstå sykdomsrelaterte mekanismer, for å samtidig kultivere med andre celletyper, i tumorgenisitetsanalyser, og i funksjonelle analyser eller transplantasjonsstudier for å avgjøre om de differensierte cellene kan redde en sykdom fenotype.

Transient behandling av humant Pluripotent stamceller med DMSO å fremme differensiering

Abstract