Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

La photolithographie est une technique puissante pour la synthèse des oligonucléotides d'ADN sur des lames de verre, car elle combine l'efficacité des réactions d'accouplement de phosphoramidite avec la précision et la densité de la lumière UV réfléchie par des miroirs de la taille d'un micromètre. La photolithographie produit des microréseaux pouvant accueillir des centaines de milliers jusqu'à plusieurs millions de séquences d'ADN différentes, 100-nt ou plus, en seulement quelques heures. Avec cet espace séquence très important, les microréseaux sont des plates-formes idéales pour explorer les mécanismes des interactions entre l'acide nucléique et ligand, qui sont particulièrement pertinentes dans le cas de l'ARN. Nous avons récemment rapporté sur la préparation d'un nouvel ensemble de phosphoramidites d'ARN compatibles avec la photolithographie in situ et qui ont été plus tard employés pour cultiver des oligonucléotides d'ARN, des homopolymères aussi bien que des séquences de base mélangée. Ici, nous animons en détail le processus de fabrication du microréseau d'ARN, de la conception expérimentale, à la configuration instrumentale, à la synthèse du tableau, à la déprotection et à l'analyse finale de l'hybridation à l'aide d'un modèle 25mer séquence contenant les quatre bases à titre d'exemple. En parallèle, nous allons au-delà des expériences basées sur l'hybridation et exploitons la microlithographie comme une passerelle peu coûteuse vers des bibliothèques complexes d'acide nucléique. Pour ce faire, les microréseaux d'ADN à haute densité sont fabriqués sur un monomère sensible à la base qui permet à l'ADN d'être facilement clivé et récupéré après synthèse et déprotection. Le protocole de fabrication est optimisé de façon à limiter le nombre d'erreurs synthétiques et, à cet effet, une couche de solution de carotène est introduite pour absorber les photons UV qui pourraient autrement se refléter sur les substrats de synthèse. Nous décrivons étape par étape le processus complet de préparation de la bibliothèque, de la conception au clivage et à la quantification.