우리는 우수한 얼룩말 물고기 축산에 대한 옥스포드와 버밍엄에서 생물 의학 서비스의 직원에게 감사드립니다. T.D.는 웰컴 트러스트 염색체 및 발달 생물학 박사 장학금 (#WT102345/Z/13/Z)에 의해 지원되었습니다. R.M.과 M.K.는 영국 심장 재단(BHF IBSR 펠로우십 FS/13/50/30436)의 후원을 받았으며, 그들의 후한 지원에 감사드립니다. R.M.은 BHF 연구 우수 센터 (RE / 13/1/30181), 옥스포드의 지원을 인정합니다.

동물 과목과 관련된 절차는 동물 (과학적 절차) 법 1986에 의해 규제되며 홈 오피스와 지역 동물 복지 및 윤리 검토 기관의 승인을 받았습니다.
1. 이미지 ISH 염색 배아
<ol><li>글리세롤 용액 (1 x PBS 버퍼에서 50 %-80 %)을 준비하고 용액을 균질화하기 위해 혼합하십시오 (예를 들어, 적어도 5 분 동안 롤러에 둡니다). 이 용액은 실온에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>현장에서 혼성화14,15,16,17,3 mL 파스퇴르 피펫으로 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 적어도 5 분 동안 정착하기 위해 둡니다. 24 hpf (시간 후 수정 후)보다 오래된 화상 진찰 배아의 경우, 그들은 설명된 대로 표백될 수 있다18.<ol>
<li>이미징 후 ISH 염색 배아를 옮길 수 있는 충분한 PCR 튜브를 준비하고 라벨을 붙입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 mL 파스퇴르 피펫으로 유리 우울증 슬라이드에 우물 바닥에 100 % 글리세롤을 추가하십시오.</li>
	<li>3 mL 파스퇴르 파이펫을 사용하여, 디지털 카메라와 하단 및 상부 조명이 장착 된 스테레오 현미경에서 필요에 따라 유리 슬라이드와 방향에 하나의 ISH 스테인드 배아를 전송합니다. 참고: 겔 로딩 파이펫 팁을 사용하여 배아를 이미징에 배치하지만 다른 도구(예: 집게, 해부 바늘)도 동일하게 적합합니다.</li>
	<li>제1 배아를 사용하여, 원하는 배율로 조명 및 노출 시간을 조절한다. 동일한 실험에서 모든 배아에 대해 이러한 조건을 사용하십시오(즉, 이형 돌연변이인교차로부터 40개의 배아를 이미징하는 경우, 조명, 노출 시간 및 배율이 모두 동일한지 확인하십시오).</li>
	<li>필요에 따라 많은 배아를 이미지화합니다. 각 이미지에 고유한 번호로 레이블을 지정합니다. 이미징 후, 동일한 번호로 표시된 PCR 튜브/플레이트에 배아를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮기십시오. 참고: 이미지는 TIF 파일로 저장해야 하지만 다른 형식도 적절합니다.<ol>
<li>필요한 경우, PCR 튜브/플레이트에서 여분의 글리세롤을 제거하십시오. 참고 : 이 시점에서 배아는 실온에서 몇 주 동안 PCR 튜브에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 추출 및 ISH 염색 배아의 유전자형
참고: 여기서, 95%-100%3의DNA 추출 효율을 가진 HoTSHOT 방법19에 기초한 게놈 DNA를 격리하기 위하여 믿을 수 있고 저렴한 방법을 이용하십시오.
<ol><li>이미징이 완료된 후, 각 튜브에 알칼리성 용해 완충액(예: HoTSHOT)의 40-75 μL을 추가합니다.</li>
	<li>95°C에서 약 30분 동안 배양하고 동일한 부피의 중화 버퍼를 추가하기 전에 튜브를 4°C로 냉각시. 4°C에서 의 하룻밤 배양은 PCR 효율을 향상시킬 수 있다. 참고: 이 시점에서 게놈 DNA는 게놈 을 위해 사용하거나 필요할 때까지 -20 °C에서 저장될 수 있습니다.</li>
	<li>적절한 방법(예를 들어, HRMA, RFLP)을 가진 유전자형샘플(예를들어,20,21) 관심의 돌연변이에 필요한 경우.</li>
	<li>각 샘플에 해당하는 유전자 형(예: 스프레드시트 소프트웨어 사용)을 기록합니다.</li>
</ol>3. ISH 염색 배아의 픽셀 강도를 정량화 (피지 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석)
<ol><li>SITU 혼성화(ISH) 염색 신호 강도를 정량화하려면 모든 이미지를 설명된 대로 8비트 그레이스케일로변환합니다. 이미지가 로 저장된 경우. TIF 파일, 일괄 변환에 피지 매크로를 사용 하 여3. 또는 다른 형식(예: . (를) TIF는 적절한 소프트웨어를 사용하여 다음 피지를 사용하여 8 비트 그레이 스케일로 변환합니다. 편의를 위해이전에3에 게시된 단계별 절차와 일부 변경이 있습니다.</li>
	<li>피지에서 이미지를 열고 편집 및 반전 및 반전. 그런 다음 이미지 유형을 8비트(이미지> 유형 > 8비트)로변경합니다.</li>
	<li>다각형 선택 도구를 사용하여 신호가 포함된 영역 주변의 이미지에 ROI(관심 영역)를 수동으로 그립니다.</li>
	<li>t를 눌러 ROI 관리자를 엽니다. ROI 관리자의 측정 명령을 사용하여 ROI의 강도를 측정합니다. 결과 창에서 평균 값을 스프레드시트 소프트웨어에 복사합니다.</li>
	<li>얼룩이 들어 있지 않은 얼룩 영역으로 원래 영역과 동일한 크기와 모양을 보장하는 동일한 ROI를 이동합니다. 3.4단계를 반복하여 배경을 측정합니다.</li>
	<li>ISH 신호의 평균 픽셀 강도를 얻으려면 각 배아에 대한 스테인드 영역의 배경 영역의 평균 강도 값을 뺍니다.</li>
	<li>각 강도 값을 유전자형에 할당합니다(2.3단계).</li>
</ol>4. 적절한 통계 테스트로 결과 분석
<ol><li>하나의 Q-Q 플롯에 있는 모든 값을 플롯하여 정규 분포의 편차를 식별합니다. 참고: 콜모고로프-스미르노프 테스트 또는 샤피로-윌크 테스트로 일반 분포를 확인할 수도 있습니다. 그러나 큰 샘플 크기의 경우 이러한 테스트에서 거짓 긍정의 위험이 높습니다.</li>
	<li>정규 분포와 큰 편차가 있는 경우 모든 값(ln 또는 sqrt 함수 사용)을 변환하여 진행하기 전에 일반적으로 분산되었는지 확인합니다.</li>
	<li>95% 신뢰 수준과 2 꼬리 ANOVA와 각 유전자형 (wt 대 이형 대 돌연변이)에 할당 된 값 (필요한 경우 변환)의 차이를 분석, 레벤의 테스트와 웰치 보정과 차이의 평등을 고려. 각 유전자형 쌍 간의 쌍별 비교를 위해 Tukey's(동등한 분산) 또는 게임 하웰(불평등 분산) 사후 테스트를 사용합니다.<ol>
<li>변환에도 불구하고 일반적으로 값이 분산되지 않는 경우 비파라메트릭 테스트(Kruskall-Wallis)를 사용하여 순위 값과 쌍으로 본페로니 보정을 사용한 사후 던의 다중 비교 테스트 간의 차이를 분석합니다. 비교.</li>
	</ol>
</li>
	<li>변환되지 않은 값(3.6단계에서)을 점 도표로 플롯하여 결과를 가장 잘 표현합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRz:+a+database+of+zebrafish+validated+sgRNAs.">CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).</li><li>Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+pipeline+for+parallel+image-based+quantification+of+gene+expression+and+genotyping+after+in+situ+hybridisation.">An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation.</a> Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).</li><li>Bresciani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBFbeta+and+RUNX1+are+required+at+2+different+steps+during+the+development+of+hematopoietic+stem+cells+in+zebrafish.">CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish.</a> Blood. 124 (1), 70-78 (2014).</li><li>Gore, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+hematopoiesis+by+DNA+methylation.">Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation.</a> Elife. 5, e11813 (2016).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Gain+of+RTK+Signalling+Uncovers+Selective+Cell+Vulnerability+during+Embryogenesis.">Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).</li><li>Wen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA5+SUMOylation+is+indispensable+for+zebrafish+cardiac+development.">GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).</li><li>Espin-Palazon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence.">Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence.</a> Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).</li><li>Genthe, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+is+required+for+zebrafish+blood+and+vessel+development+and+expression+of+a+human+RUNX1-CBF2T1+transgene+advances+a+model+for+studies+of+leukemogenesis.">Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis.</a> Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).</li><li>Butko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata2b+is+a+restricted+early+regulator+of+hemogenic+endothelium+in+the+zebrafish+embryo.">Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo.</a> Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lleras Forero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+of+the+zebrafish+axial+skeleton+relies+on+notochord+sheath+cells+and+not+on+the+segmentation+clock.">Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Jowett, T., Yan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+in+situ+hybridization+to+zebrafish+embryos.">Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos.</a> Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Narayanan, R., Oates, A. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation:+A+phenomenon+in+search+of+mechanisms.">Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).</li><li>Meier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+partners+of+Ldb1+are+required+for+haematopoietic+development.">Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development.</a> Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Leung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+VEGFA+functions+in+arteriogenesis+and+hematopoietic+stem+cell+specification.">Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification.</a> Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).</li></ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

유전자 발현을 정량화하기 위하여 이 방법을 사용할 때 몇몇 요인이 고려되어야 합니다. 이미징 조건은 측정 사이의 가변성을 줄이기 위해 실험 전반에 걸쳐 유지되어야 합니다(예: 조명, 노출 시간 및 배아 위치 지정). 중요한 점은 샘플 간의 염색 의 차이가 가려질 수 있기 때문에 샘플의 과중 얼룩을 피하는 것입니다. 예를 들어, 제노푸스 라에비스 배아(30)에서 Eto2가 없는 경우 VegfA 발현의 감소는 24시간 동안 염색을 주의 깊게 모니터링하여검출될 수 있었다. 따라서, 경험적으로 포화에 도달하지 않고, 그것의 발현을 가장 잘 나타내는 각 유전자에 대한 적절한 염색 수준을 결정하는 것이 좋습니다. 또한 오버스테인은 변환된 8비트 그레이스케일 이미지의 배경 픽셀 강도를 인위적으로 증가시키고 정량 결과를 왜곡합니다. 극단적인 경우에, 배아 조직에 있는 배경 수준은 선택된 ROI에 있는 ISH 신호 보다는 높을 지도 모르다 및 이 견본은 분석에서 제외되어야 합니다. 배경 보정을 위해 얼룩지지 않은 노른자의 적합성을 테스트했을 때 유사한 현상이 관찰되었습니다(도4). 반전 및 8비트로 변환된 후 노른자 영역의 어두운 픽셀은 배아의 ISH 신호보다 밝아지고 배경 보정 값을 음수로 렌더링합니다. 따라서, 배경 보정을 위해 노른자의 사용을 피한다. 배아의 색소 부위(예: 26/28 hpf 이후의 트렁크의 눈 또는 등쪽 부분)에서 배경 신호를 측정하면 정량 결과를 똑같이 왜곡하고 피해야 합니다. 제브라피쉬 배아 표백에 사용할 수 있는 프로토콜이 있는데, 이는 이미징이 권장되기 전에 ISH18 및 24 hpf 이상의 표백 배아를 표백하기 전이나 후에 가능합니다.
이 방법은 동등한 비염색 영역에서 배경 픽셀 강도에 대해 정의된 영역에서 픽셀 강도를 측정하는 데 의존하기 때문에 유비쿼터스 또는 유비쿼터스 발현 된 유전자의 양량화에는 적절하지 않습니다. 대신, 배경 픽셀 강도를 측정하기 위한 영역을 쉽게 식별할 수 있는 공간적으로 제한된 분포를 가진 유전자의 발현을 측정하는 데 적합합니다. 우리의 추가 분석은 이제 배경 보정을 위해 더 작은 영역 (3-4 배 더 작음)을 사용하면 ROI와 동등한 영역을 사용하는 것과 유사한 결과를 얻을 수 있음을 시사합니다. 이것은 배경 보정을 위해 배아의 명확한 얼룩이 없는 영역을 사용할 수 있는 한 더 넓은 공간 도메인에서 발현되는 유전자(따라서 강도 측정을 위해 더 큰 ROI를 요구함)로 이 방법의 적용 가능성을 확장합니다.
마지막으로, 실험자 편향을 최소화하기 위해 이미지 정량화 후 또는 실험자 비측을 병렬로 수행하거나 이를 수행하는 것이 좋습니다. 두 번째 실험자가 익명화된 샘플의 정량을 반복하고 첫 번째 측정 세트와 비교하도록 요청하면 실험자의 편향을 줄이는 데도 도움이 됩니다. 정량화할 이미지가 유전형 질이 필요하지 않은 치료법 간의 비교(예: 야생형 대 화학억제제 또는 야생형 대 MO 녹다운)의 비교에서 나온 경우, 측정을 수행하는 실험자는 샘플.

게놈 편집 기술 (ZFN, TALEN 및 최근에는 CRISPR /Cas9)의 도입은 생체 내에서 특정 유전자의 기능을 연구하기 위해 이러한 시스템을 사용하는 전 세계 실험실의 수가 크게 증가했습니다. 특히 제브라피쉬는 유전적 조작이 가능하며 최근1,2에서많은 돌연변이가 발생하고 있다. 발달 생물학자를 위해, 배아 발달에 있는 유전자 돌연변이의 현상상 결과를 평가하는 일반적인 방법의 한개는 situ 혼성화에 있습니다 (ISH). 그들의 야생 모형 또는 이형 형제에서 동형 접합 돌연변이를 분리하는 명백한 형태학적 결함이 없는 경우에, 정확하게 다른 유전형을 정확하게 확인할 수 있는 것이 필수적입니다.
고전 ISH는 관심있는 유전자와 선택된 마커 유전자 사이의 규제 상호 작용에 대한 결론을 도출하기 위해 신호 강도의 질적 분석에 의존합니다. 유용하지만 이러한 분석은 기술적 변화로 인해 어려움을 겪고 있으며 연구자 기대치에 의해 편향될 수 있습니다. 따라서, 상응하는 유전자형에 대한 사전 지식 없이, 이식된 ISH 염색 배아를 이미징한 후 유전자 발현을 정량화하는 방법이 개발되었다. 이것은 우리가 유전자 발현3과유전자형을 정량적으로 상관시키는 것을 허용하는 능률적인 DNA 추출 및 유전자 형질분석이 뒤따랐습니다. 4, 5, 이미지 기반 의 정량화는연구6,7을제외하고는 널리 사용되지 않은,4,5,이전에 사용되어 온 배아포스트ISH의 지질형 화. 가장 인기있는 대안은 시각적 인 채점 또는 ISH 염색 세포의 계산에 의존8,9,10,모두 가난한 재현성과 연구자 편견에 경향이있다. 이 방법은 특히 runx1 또는 gata2b와같이 공간적으로 제한되는 발현 패턴을 가진 유전자의 변화를 연구하는데 유용하며, 둘 다 혈생 내피(11,12)라고불리는 대동맥 바닥 세포의 제한된 서브세트에서 발현된다.
여기서, 우리는 피지13을이용한 영상 분석에 의한 정량화의 구현에 대한 실용적인 가이드뿐만 아니라 DNA 추출 및 지질질성 분석 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 한다. 이는 이전에 게시된 메서드3을시각적으로 설명하기 위한 것입니다. 우리의 방법은 특정 유전자형에 대한 ISH 및 유전자 발현 수준의 편견 없는 할당에 의해 검출된 유전자 발현의 변이의 정확한 표현을 허용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids)</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>A1402-3700</td>
			<td>96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavity slides</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR475535-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0)</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10289651</td>
			<td>the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3000 Fiber Optic Cold Light Source</td>
			<td>Photonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.01</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT alkaline lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT neutralization buffer</td>
			<td></td>
			<td>Tris HCl 40 mM, pH 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish

situ 혼성화에서 (ISH)는 연구원이 그(것)에 있는 mRNA 분포를 공부하는 것을 가능하게 하는 중요한 기술이고 수십 년 동안 발달 생물학에 있는 중요한 기술이었습니다. 전통적으로, 대부분의 유전자 발현 연구는 특히 샘플 정체성이 선험적이라고 알려진 경우에, 편견에 수그린 방법인 ISH 신호의 시각적 평가에 의존했습니다. 우리는 이전에 이러한 편견을 우회하고 ISH 신호의 보다 정확한 정량화를 제공하는 방법에 대해 보고했습니다. 여기에서, 우리는 ISH 염색한 태아에 있는 관심 있는 유전자의 발현 수준을 정량화하고 그들의 대응하는 유전자형과 상관관계를 지정하기 위하여 이 방법을 적용하는 간단한 가이드를 제시합니다. 이 방법은 혼합 된 유전자형의 샘플에서 공간적으로 제한된 유전자 발현 신호를 정량화하는 데 특히 유용하며 전통적인 시각적 채점 방법에 대한 편견없고 정확한 대안을 제공합니다.

여기서, 우리는 다른 곳에서 출판 된 바와 같이 이미지 정량 및 배아 지질 형질 에 대한 파이프 라인의 실제 적용을 설명3. 메서드에 대한 워크플로는 그림 1에표시됩니다. 이 방법을 사용하는 방법을 설명하기 위해, ISH는 runx1W84X/+22 인크로스로부터 33hpf 배아에서 dnmt3bb.1에 대해 수행하였다(그림2). 130개의 배아는 프로토콜에 상세히 설명된 것과 동일한 조명 조건을 사용하여 이를 고유 번호로 표시하여 화상했다. 화상 진찰 후에, 각 태아는 GENOTYping을 위한 PCR 관으로 옮겨졌습니다. 이 시점에서, 이미지 분석은 각 이미지에 픽셀 강도 값을 속성으로 수행되었다. 그 때 유전자형은 통계 분석을 위한 그들의 유전자형에 따라 그(것)들의 그 상응하는 심상 및 픽셀 강렬 값에 할당되었습니다. dnmt3bb.1 식의 감소는 runx1W84X/W84X 돌연변이체(그림2A, B)3에서이전 관측값5와일치하여 검출되었다. 흥미롭게도 Runx1W84X/+ 이형이후 배아는 야생 형 형제에 비해 dnmt3bb.1 발현(그림 2A, B)에서유의한 차이를 보이지 않았으며, Runx1의 한 복사본이 적절한 수준에서 dnmt3bb.1 발현을 유지하기에 충분하다는 것을 시사합니다.
많은 제브라피쉬 돌연변이체는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(MoOs)와 같은 기능 기술의 다른 손실을 사용하여 검출될 수 있는 배아 표현형을 보여주지 못합니다. 이러한 불일치는 오프 타겟 효과, 모계 단백질 보상, 저형대립유전자(23) 또는 최근에 발견된 유전적 보상(24,25,26,27)등의 여러 원인에 기인할 수 있다. 이 예에서, 우리는 lmo4a mo를 사용하여 이전에 게시된 데이터가 lmo4a 형태(28)에서 runx1이 감소된다는 것을 제안했기 때문에 lmo4a uob100 돌연변이체에서 runx1 발현이 감소또는 손실되었는지 를 물었다. 여기서, 분석은 야생형과 lmo4auob100 동형 돌연변이체 들 사이의 runx1 발현에서 유의한 차이를밝혀냈다 3 (도 3A, B). 단일 배아 qPCR에 의한 추가 분석은 lmo4auob100 돌연변이체에서 runx1 발현이 작지만 유의한 감소를 보였다(도3C). 따라서 이미지 정량화가 표현 수준에서 작은 차이를 감지하지 못할 수 있습니다. 양자택일로, 우리가 검출한 유전형 사이 다름의 부족은 진짜이고 qPCR 실험은 lmo4a와 runx1 둘 다 표현되는 telenchephalon 같이 그밖 조직에서 runx1 표현에 있는 변경을 검출하고 있습니다. 연구원은 항상 qPCR 같이 독립적인 방법으로 그들의 결과를 확인해야 합니다, 그러나 이상적으로 유세포 측정에 의하여 관심있는 조직을 위해 풍부하게, 예를 들면.
드물게 ISH의 배경이 높은경우(그림 3D)이 영역의 픽셀 강도 값이 너무 높아서 신호 값에서 빼면 음수가 생성되며 이러한 경우 배아는 분석에서 제외됩니다. 우리의 경험에서, 이것은 runx1-probed 배아3의 대략 0.4%에서 생겼습니다 그러나 실험, 탐사기 또는 시약의 배치 사이에서 변화할 수 있습니다. 이 방법의 제한일 수 있지만 높은 배경의 낮은 주파수는 전체 결과에 영향을 미치지 않을 수 있습니다.
배경 보정을 위해 다른 영역을 선택하는 효과를 테스트하기 위해 먼저 배경 보정을 위해 서로 다른 영역을 사용하여 28 hpf 배아에서 runx1 ISH 신호의 픽셀 강도를 측정했습니다(그림4). 4개의 상이한 지역이 선택되었다: 트렁크 영역(R1, 및 R2)에서 2개, 노른자 영역에서 하나(얼룩이 없지만 배경 염색이 축적될 가능성이 있음) 및 ROI에 대한 더 작은 영역(R4, 도 4B). 이들 영역에서 픽셀 강도를 측정한 결과 ROI와 배경 영역 중 어느 쪽의 배경 영역 사이의 강도가 비교적 안정적으로 차이를보였다(그림 4C). 그러나 R3는 항상 매우 높은 값을 보였습니다(ROI의 값 보다 높음). 반전 및 8 비트로 변환 한 후 노른자 영역은 매우 밝게 나타나므로 배경 보정으로 사용하기에 적합하지 않습니다. R2는 ROI에 더 가까웠지만 일부 ISH 신호를 포함하고 보정을 위해 사용하면 R1(ISH 신호에서 멀리 떨어진 곳에 위치) 또는 R4와 비교할 때 평균 픽셀 강도가 감소했습니다. 따라서 R1 또는 R4는 배경 보정에 사용할 수 있는 적절한 영역입니다(R4의 영역이 R1보다 작음에도 불구하고). 다음으로 runx1 식을 비교할 때 R1 또는 R4를 사용하여 결과에 미치는 영향을 비교하려고 했습니다. 이를 위해, 우리는 dll4+/- 이형지29를 교차시키고 무작위로 선택된 야생형 및 dll4-/- 배아에서 runx1 발현을 분석하였다(도4E). 배경 보정에 R1 또는 R4를 사용하여 개별 값에 영향을 미쳤지만 동일한 유전자형 내의 평균 픽셀 강도는 크게 다르지않았습니다(그림 4E). 또한 runx1 식을 비교하면 R1 또는 R4 영역을 배경 보정으로 사용하는 유전자 형 간의 유사한 평균 강도 값이 여전히 생성됩니다(μR1=16.3 및 μR4=18.2). 종합하면 배경 영역의 선택이 중요하지만 주요 기준은 노른자 영역 (배경 얼룩이 축적되기 쉽다)을 포함하지 않으며 배경의 픽셀 강도 값을 왜곡 할 수있는 (특정) 얼룩을 포함해서는 안된다는 결론을 내렸습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig1a.jpg"> 그림 1: 병렬 이미지 정량 및 지질형 프로토콜의 워크플로우. 돌연변이 대열유전자에 대한 물고기 이형의 인크로스로부터 수집된 배아는 표준 ISH 프로토콜을 가진 측정된 유전자에 대해 조사된다. 이미징 후, 게놈 DNA는 0.2 mL PCR 튜브에서 배아에 직접 용해 완충액을 첨가하여 HotSHOT 프로토콜을 사용하여 추출되고, 이어서 95°C에서 30분 배양한다. 이 DNA는 PCR, PCR 및 제한 단편 길이 다형성(RFLP), KASP 검사 또는 임의의 다른 적절한 방법에 의해 배아의 지질학적 인자 검사에 사용된다. 병행하여 각 배아의 이미지는 반전되어 8비트 그레이스케일로 변환됩니다. ISH 신호(노란색)와 배경(파란색)을 포함하는 동일한 모양 및 크기의 ROI를 수동으로 선택하고 측정합니다. 해당 유전자형에 할당된 측정은 통계적으로 분석됩니다. Dobrzycki 외 에서 적응 그림3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig02.jpg"> 도 2: runx1 돌연변이체의 이미지 정량은 ISH에 의한 dnmt3bb.1 발현의 감소된 수준을 드러낸다. (a)33 hpf 야생형(파랑), runx1+/W84X(녹색) 및 runx1W84X/W84X(주황색) 배아의 실시예 이미지는 등대치에서 dnmt3bb.1 발현을 나타냈다. (B) runx1W84X/W84X배아에서 dnmt3bb.1 mRNA의 픽셀 강도 값(n=36)은 야생 유형(n=32) 및 이종고트(n=62)(ANOVA, p< 0.001)에 비해 현저히 감소합니다. 변이 계수는 야생 형, 이종이고 및 돌연변이 기의 경우 각각 24%, 22% 및 21%입니다. 파란색, 녹색 및 주황색 데이터 점은 패널 A의 예제 이미지와 일치합니다. 막대는 평균 ± s.d. ***p<0.001(게임-하웰 사후 테스트)을 나타냅니다. Dobrzycki 외 에서 적응 그림3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig03.jpg"> 도 3: lmo4auob100돌연변이체에서 ISH에 의한 runx1 발현 수준을 측정한다. (a)28hpf 야생형(청색), 이종지(녹색) 및 lmo4auob100(주황색) 배아에서 runx1에 대한 ISH의 대표적인 이미지는 등쪽 대강물에서 발현을 나타내고 있다. (B) runx1 mRNA 신호의 정량화, ISH에 의해 검출된 28 hpf 야생 유형(n=15), 이형시구스 lmo4a+/- (het) (n=34) 및 lmo4auob100/uob100 돌연변이체(n=18) 배아에서 하나의 클러치에서 다른 유전자형 들(ANOVA,> 0.0)의 runx1 픽셀 강도에 유의한 차이가 없음을 나타낸다. 파란색, 녹색 및 주황색 데이터 점은 패널 A의 예제 이미지와 일치합니다. 막대는 단일 야생 유형(파란색; n=12) 및 lmo4auob100/uob100(뮤트, 주황색; n=12) 배아에서 정규화된 runx1 mRNA 수준(2-ΔCt)을 표시하는 평균 ±s.d.(C)박서플롯을 나타내며, qRT-PCR에 의해 측정된 배아, 돌연변이체에서 의 감소된 룬x1 수준을 나타낸다. *p < 0.05(t 테스트). (D)높은 배경을 나타내는 28 hpf 배아(runx1, 노란색 화살촉에 대해 염색)에 대한 ISH 실험의 예. Dobrzycki 외 에서 적응 그림3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig04.jpg"> 그림 4: 측정 결과에 대한 배경 강도 보정효과. (A)28 hpf에서 야생형 배아에서 runx1 ISH 염색의 대표적인 이미지. (B)8 비트로 반전 및 변환 후 동일한 이미지. 관심 영역(ROI)이 녹색으로 강조 표시되고 배경 보정에 사용되는 네 개의 다른 영역(R1-R4)이 노란색으로 강조 표시됩니다. (C)패널 B에 표시된 모든 영역의 원시 픽셀 강도 측정은 R3(노른자)의 강도가 ROI의 실제 ISH 신호(n=11)보다 일관되게 높다는 점에 유의하십시오. (D)R1, R2 및 R4 배경 영역을 사용하여 ROI에서 Runx1 표현 수준입니다. ROI, R1, R2 및 R3~28500 픽셀에 대한 영역; R4 ~ 8500 픽셀. 배경 보정(ROI-R3)이 지속적으로 음수 값을 산출함에 따라 R3 배경이 이 비교에 사용되지 않았습니다. (e)배경 보정을 위해 R1 또는 R4를 사용하는 야생 형 및 dll4-/- 돌연변이체의 Runx1 발현 수준(각 샘플에 대해 n=10). 패널 D와 E의 통계 분석은 픽셀 강도 값이 일반적으로 분포되지 않는다고 가정하여 비파라메트릭 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

유전자 편집 기술은 연구원이 상대적으로 쉽게 유전자 기능을 조사하기 위해 제브라피시 돌연변이를 생성할 수 있게 했습니다. 여기서, 우리는 제브라피시에서 의 회동 배아 하노티핑 및 정량화 신호를 수행하는 가이드를 제공한다. 이러한 편견없는 접근 방식은 situ 하이브리드화를 기반으로 한 현상별 분석에서 더 높은 정확도를 제공합니다.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

유전자 발현에 돌연변이의 결과는 수시로 현장에서 혼성화에 의해 질적으로 평가되고 일반적으로 연구원의 기대에 의해 주관적이고 편향되는 시각적으로 득점됩니다. 이 방법은 이미지 강도를 정량화하여 시투 실험에서 비교할 수 있는 보다 일관된 방법을 제공하고 해당 바이어스를 제거합니다. 이것은 또한 유전자 발현의 판독기로 시상 혼성화에서 사용하는 다른 모델 시스템에 쉽게 적응될 수 있다.시상 혼성화 또는 ISH 염색 배아를 이미징하여 시작합니다. 글리세롤 용액을 준비하고 혼합하여 균질화합니다. 3 밀리리터 파스퇴르 파이펫으로 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 적어도 5분 동안 정착하게 한다.이미징 후 ISH 스테인드 배아를 전송하기에 충분한 PCR 튜브를 준비하고 라벨을 붙인 다음 3밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유리 우울증 슬라이드의 우물 바닥에 100% 글리세롤을 추가합니다. 단일 ISH 스테인드 배아를 유리 슬라이드로 옮기고 디지털 카메라와 바닥 및 상단 조명이 장착된 스테레오 현미경으로 방향을 지정합니다. 첫 번째 배아를 사용하여 원하는 배율에서 조명 및 노출 시간을 조정합니다.필요에 따라 많은 배아를 이미지화하고 각 이미지에 고유한 번호로 레이블을 지정합니다. 이미징 후 각 배아를 동일한 번호로 표시된 PCR 튜브로 옮기고 필요한 경우 PCR 튜브에서 과도한 글리세롤을 흡인시합니다. DNA를 추출하려면 각 튜브에 HoTSHOT과 같은 알칼리성 리시스 버퍼의 40~75마이크로리터를 추가합니다.약 30분 동안 95도의 튜브를 배양한 다음 섭씨 4도로 식힙니다. 동일한 양의 중화 버퍼를 추가하고 관심 있는 돌연변이를 위한 유전화를 진행합니다. 이미지 분석을 수행하려면 피지에서 이미지를 선택하고 열고 편집을 클릭한 다음 반전한 다음 이미지 탭을 클릭하고 Type을 선택하고 8비트를 선택하여 이미지 유형을 8비트로 변환합니다.다각형 도구를 선택하고 측정할 ISH 신호를 포함하는 영역 주위의 이미지에 관심 영역 또는 ROI영역을 수동으로 그립니다. T를 눌러 ROI 관리자를 열고 관심 영역을 선택한 다음 측정값을 클릭합니다. 결과 창에서 스프레드시트에 평균 값을 복사합니다.배경 강도를 측정하려면 ROI를 염색하지 않고 배아의 영역으로 이동하고 ROI 관리자에 추가를 클릭합니다. 백그라운드 영역을 선택하고 측정값을 클릭한 다음 스프레드시트에서 평균 강도 값을 기록합니다. 스테인드 영역의 배경의 평균 강도를 빼서 NC2 혼성화 신호의 평균 픽셀 강도를 가져옵니다.모든 샘플의 평균 픽셀 강도를 결정한 후 각 샘플에 유전자형을 할당합니다. 유전자형을 확인할 수 없는 경우 후속 분석에서 샘플을 제외합니다. 유전자형에 따라 평균 표본 강도 값을 정렬하고 통계 테스트를 진행합니다.이 기술의 유용성은 dnmt3bb에 대한 ISH에서 입증되었습니다. runx1 이종구우스 크로스에서 배아에서 1. dnmt3bb의 감소.1 발현은 runx1 homozygous 돌연변이체에서 검출되었으며 이종화 구균 배아는 dnmt3bb에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 식 1개. lmo4 돌연변이가 runx1 발현에 미치는 영향을 확인하려고 시도할 때, 이 분석은 야생 유형과 호모니구스 lmo4 돌연변이체 사이의 표정에 상당한 차이를 나타내지 않았다.그러나, runx1 발현의 작은 감소는 단일 배아 qPCR에 의해 검출되었다. runx1 프로브 배아의 약 0.4%에서 ISH는 신호에서 빼졌을 때 음수의 결과로 높은 배경을 가지고 있었습니다. 이러한 경우, 배아는 분석에서 제외되었다.배아의 4개의 다른 지구는 배경 보정을 낙낙하기 위하여 시험되었습니다. 배경 영역에서 ROI의 강도가 상대적으로 안정적인 차이가 있었지만 R3는 항상 ROI보다 높은 강도를 보였으며 배경 보정에 사용해서는 안됩니다. R1 과 R4는 배경 보정에 가장 적합한 영역으로 입증되었습니다.이미징을 위한 최상의 조건을 찾고 실험 전반에 걸쳐 변경되지 않는 유지하는 것이 중요합니다. 또한 각 샘플에 유전자형을 할당하기 전에 픽셀 강도를 정량화하는 것이 좋습니다.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

Abstract