Parasponia andersonii è un albero tropicale in rapida crescita che appartiene alla famiglia Cannabis (Cannabaceae) e può formare noduli di radice che fissano l'azoto in associazione con il rizobium. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per le analisi genetiche inverse in P. andersonii basato su Agrobacterium tumefaciens- mediato trasformazione stabile e modifica del genoma CRISPR/Cas9.
Parasponia andersonii è un albero tropicale in rapida crescita che appartiene alla famiglia Cannabis (Cannabaceae). Insieme a 4 specie aggiuntive, forma l'unico lignaggio non legume conosciuto in grado di stabilire una simbiosi nodule che fissa l'azoto con il rizobio. Studi comparativi tra legumi e P. andersonii potrebbero fornire preziose informazioni sulle reti genetiche alla base della formazione dei noduli delle radici. Per facilitare gli studi comparativi, abbiamo recentemente sequenziato il genoma di P. andersonii e stabilito Agrobacterium tumefaciens- mediato trasformazione stabile e editing del genoma basato su CRISPR/Cas9. Qui, forniamo una descrizione dettagliata delle procedure di trasformazione e di editing del genoma sviluppate per P. andersonii. Inoltre, descriviamo le procedure per la germinazione dei semi e la caratterizzazione dei fenotipi simbiotici. Utilizzando questo protocollo, possono essere generate linee mutanti transgeniche stabili in un periodo di 2-3 mesi. La propagazione vegetativa nella propagazione in vitro delle linee transgeniche T0 consente di avviare esperimenti di fenotipizzazione a 4 mesi dopo la co-coltivazione di A. tumefaciens. Pertanto, questo protocollo richiede solo marginalmente più tempo del metodo transitorio di trasformazione della radice basato su Agrobacterium rhizogenesdisponibile per P. andersonii, anche se offre diversi vantaggi chiari. Insieme, le procedure qui descritte permettono a P. andersonii di essere utilizzato come modello di ricerca per studi volti a comprendere le associazioni simbiotiche e potenzialmente altri aspetti della biologia di questo albero tropicale.
Parasponia andersonii è un albero tropicale appartenente alla famiglia Cannabis (Cannabaceae) ed è nativo di Papua Nuova Guinea e diverse isole del Pacifico1,2,3. Insieme ad altre 4 specie di Parasponia, rappresenta l'unico lignaggio non legume in grado di stabilire una simbiosi nodule che fissa l'azoto con la rizobia. Questa simbiosi è ben studiata nei modelli di legume (Fabaceae) Medicago truncatula e Lotus japonicus, che ha portato all'acquisizione di una conoscenza dettagliata della natura genetica molecolare della formazione dei noduli e del funzionamento4. Inoltre, è stato dimostrato che la simbiosi nodule radice nei legumi si basa sulla simbiosi micorrizica molto più antica e diffusa5 . I confronti filogenomici suggeriscono che le simbiosi noduli che fissano l'azoto dei legumi, Parasponia, così come le cosiddette specie di piante actinorhizal che ospitano batteri Frankia diazotrofica che ospitano, hanno un'origine evolutiva condivisa 6,7,8. Per determinare se i geni identificati per essere coinvolti nella formazione del nodulo legume sono parte di una base genetica conservata, gli studi sulle specie non legumi sono essenziali. A tal fine, proponiamo di utilizzare P. andersonii come modello di ricerca comparativa, insieme ai legumi, per identificare le reti genetiche fondamentali alla base della formazione e del funzionamento dei noduli delle radici.
P. andersonii è un pioniere che si può trovare sulle pendici delle colline vulcaniche. Può soddisfare velocità di crescita di 45 cm al mese e raggiungere lunghezze fino a 10 metri9. P. andersonii alberi sono impollinati dal vento, che è facilitato dalla formazione di fiori maschili e femminili separati3,10. Recentemente abbiamo sequenziato e annotato il genoma diploide (2n - 20; 560 Mb/1C) di P. andersonii, e assemblato sequenze di genoma di progetto di 2 specie aggiuntive di Parasponia; P. rigida e P. rugosa6. Questo ha rivelato 35.000 dollari modelli genici P. andersonii che possono essere raggruppati in >20,000 ortogruppi insieme ageni da M. truncatula, soybean (Glycine max), Arabidopsis thaliana, fragola bosco ( Fragaria vesca), Trema orientalis, pioppo di cotone nero (Populus trichocarpa) e eucalipto (Eucalyptus grandis)6. Inoltre, i confronti tratrascrittomi tra M. truncatula e P. andersonii hanno identificato una serie di 290 ortologhi putativi che mostrano un modello di espressione con valori nodulo in entrambe le specie6. Ciò costituisce un'eccellente risorsa per gli studi comparativi.
Per studiare la funzione genica nelle radici e nei noduli di P. andersonii, è stato stabilito un protocollo per la trasformazione della radice mediata Agrobacterium -mediata11. Utilizzando questo protocollo, le piante composte che portano radici transgeniche possono essere generate in un lasso di tempo relativamente breve. Questo metodo è, inoltre, ampiamente applicato nella ricerca legume-simbiosi12,13,14. Tuttavia, lo svantaggio di questo metodo è che solo le radici vengono trasformate e che ogni radice transgenica rappresenta un evento di trasformazione indipendente, con conseguente variazione sostanziale. Inoltre, la trasformazione è transitoria e le linee transgeniche non possono essere mantenute. Questo rende la trasformazione della radice basata su A. rhizogenesmeno adatta per l'editing genomico mediato da CRISPR/Cas9. Inoltre, A. rhizogenes trasferisce i suoi geni locus (rol) che inducevano la radice al genoma della pianta, che una volta esprimeva interferiscono con l'omeostasi dell'ormone15. Questo rende difficile studiare il ruolo degli ormoni vegetali nelle radici trasformate da A. rhizogenes. Per superare questi limiti, abbiamo recentemente sviluppato un protocollo per la trasformazione basata su Agrobacterium tumefaciense la mutagenesi mediata CRISPR/Cas9 di P. andersonii10.
Qui, forniamo una descrizione dettagliata della procedura di trasformazione a. tumefaciense della pipeline di genetica inversa sviluppata per P. andersonii. Inoltre, forniamo protocolli per la gestione a valle delle piastrine transgeniche, inclusi i saggi per studiare le interazioni simbiotiche. Utilizzando il protocollo qui descritto, possono essere generate più linee transgeniche in un periodo di 2-3 mesi. In combinazione con la mutagenesi mediata DA CRISPR/Cas9, questo permette una generazione efficiente di linee mutanti ad eliminazione diretta. Queste linee mutanti possono essere propagate in vitro10,16,17, il che consente di generare materiale sufficiente per iniziare la caratterizzazione fenotipica a 4 mesi dopo che la procedura di trasformazione è stata stato avviato10. Insieme, questa serie di procedure dovrebbe consentire a qualsiasi laboratorio di adottare P. andersonii come modello di ricerca per studi volti a comprendere le associazioni rizobiali e micorriche, nonché potenzialmente altri aspetti della biologia di questo albero tropicale.
1. Coltivare P. andersonii Alberi nella serra
2. Clonazione di costrutti per la Mutagenesi mediata CRISPR/Cas9 di P. andersonii
NOT: I vettori di trasformazione binaria standard possono essere utilizzati per la trasformazione stabile di P. andersonii. Qui, ad esempio, è una procedura per generare costrutti per la mutagenesi mediata CRISPR/Cas9 utilizzando la clonazione modulare (ad esempio, Golden Gate)19.
3. Trasformazione stabile di P. andersonii
4. Genotipizzazione di germogli putativi-transgenici
5. Preparazione delle piantine Radicate P. andersonii per la sperimentazione
6. Nodulation delle piantine P. andersonii in vasi
7. Nodulation delle piastre P. andersonii sulle piastre
8. Nodulation of P. andersonii Seedlings in Pouches
9. Nodule Cytoarchitecture Analisi
10. Mycorrhization di P. andersonii Plantlets
P. andersonii trees può essere coltivato in una serra condizionata a 28 e 85 % di umidità relativa (Figura 1A). In queste condizioni, gli alberi iniziano a fiorire a 6-9 mesi dopo la semina. I fiori p. andersonii femminili producono bacche che contengono ciascuno un singolo seme. Durante la maturazione, le bacche cambiano colore; prima dal verde al bianco e successivamente dal bianco al marrone (Figura 1B). I semi estratti dalle bacche marroni maturate germinano bene dopo un ciclo di temperatura di 10 giorni e un'incubazione di 7 giorni su piastre SH-0 (Figura 1C). Semi germinati continuano a svilupparsi in giovani piantine che possono essere utilizzati per la sperimentazione dopo 4 settimane (Figura 1D).
Abbiamo dimostrato in precedenza che i piccioli e i segmenti dei giovani steli P. andersonii possono essere trasformati in modo efficiente utilizzando il ceppo A. tumefaciens AGL110. All'inizio della procedura di trasformazione, gli esplants tissutali sono co-coltivati con A. tumefaciens per 2 giorni a 21 gradi centigradi (Figura 2A). La co-coltivazione prolungata comporta l'eccessiva colonizzazione degli espianti tissutali da parte di A. tumefaciens e dovrebbe quindi essere prevenuta (Figura 2B). Dopo il periodo di co-coltivazione, gli espianti dei tessuti vengono trasferiti a supporti selettivi, il che favorisce la crescita del tessuto trasformato. Due o tre settimane dopo, piccoli microcalli verdi sono generalmente osservati lungo la superficie originale della ferita (Figura 2C). Questi calli dovrebbero continuare a crescere e sviluppare 1 o più germogli trasformati in modo putativo a 6-8 settimane dopo l'avvio della procedura di trasformazione (Figura 2D). In questa fase, l'efficienza della trasformazione varia in genere dal 10 al 30% per le trasformazioni avviate con espespie tissutali prelevati da rami maturi e in parte legnosi (tabella 7). Se si avviano trasformazioni con espianti tratti dalle punte giovanili e in rapida crescita di rami che non portano ancora fiori, si possono ottenere efficienze di trasformazione del 65-75% (tabella7). Occasionalmente, i calli biancascali si formano sul lato di un espianto che non è in contatto con il mezzo e, pertanto, non sperimentano la selezione della kanamicina. Questi calli spesso non sono transgenici e qualsiasi germoglio formato da questi calli sarà generalmente candeggina e morire dopo il contatto diretto con la kanamicicina contenente mezzo (Figura 2E). Nel caso in cui il tasso di trasformazione sia basso e/o che il materiale iniziale non fosse ottimale, i pezzi di tessuto potrebbero diventare marroni (Figura 2F) e soffrire di eccessiva proliferazione da parte di A. tumefaciens (Figura 2G). Per evitare che A. tumefaciens si diffondano e crescano eccessivamente crescono gli espiante vicine, è necessario un rinfresco regolare del mezzo e gli espianti gravemente infetti devono essere rimossi. Una volta che i singoli germogli transgenici sono collocati nel mezzo di propagazione, la sovraproliferazione da parte di A. tumefaciens non si verifica più (Figura 2H). I germogli transgenici possono essere moltiplicati attraverso la propagazione in vitro, che darà origine a decine di germogli in un periodo di un mese (Figura 3A-B). Questi germogli possono essere posizionati su un mezzo di radicamento, che dovrebbe indurre la formazione della radice dopo 2 settimane (Figura3C-D). Le piastrine radicate possono essere successivamente utilizzate per la sperimentazione.
Per creare linee mutanti ad eliminazione diretta, ci facciamo uso della mutagenesi mediata CRISPR/Cas9. A tal fine, utilizziamo un vettore binario contenente il gene di resistenza della kanamicina NPTII, una sequenza di codifica Cas9 guidata dal promotore CaMV35S e 2 sgRNA per gene bersaglio che sono espressi dal piccolo promotore di RNA AtU6p20. Una rappresentazione grafica del costrutto utilizzato per la mutagenesi mediata CRISPR/Cas9 di P. andersonii è fornita nella Figura 4A. Utilizzando questo metodo, l'editing del genoma è osservato nel 40% dei germogli con trasformazione putativa10. Per identificare le linee mutanti, i germogli trasformati in modo putativo sono genotipizzati per le mutazioni nei siti bersaglio dello sgRNA utilizzando primer che attraversano la regione bersaglio. Un esempio dei risultati attesi è dato in Figura 4. Come si può vedere dalla foto scattata dopo l'elettroforesi gel, diversi campioni producono un amplificatore PCR con dimensioni simili al tipo selvaggio (Figura 4B). Queste piante possono contenere piccoli indel che non possono essere visualizzati dall'elettroforesi gel agarose o rimanere inediti dall'enzima Cas9. Inoltre, diversi campioni producono bande di dimensioni diverse dal tipo selvaggio (ad esempio, linee 2, 4, 7 e 8 nella figura 4B). In queste righe, 1 (linee 4, 7 e 8) o entrambi (linea 2) alleli contengono indels più grandi che possono essere facilmente visualizzati. L'esatta natura delle mutazioni nei siti di destinazione viene rivelata dopo il sequenziamento dell'amplio PCR. Come si può vedere dalla figura 4C, sia piccoli indels di 1-4 bp, così come, le eliminazioni più grandi possono essere ottenute dopo la mutagenesi CRISPR/Cas9. Nella figura 4C, la sequenza della riga 1 è identica a quella del tipo wild, a indicare che questa riga è stata sottoposta a escape nella modifica e, pertanto, deve essere eliminata. Tra le linee che contengono mutazioni, possono essere identificati mutanti etetozigosi, omozigi e biallelici (Figura 4C). Tuttavia, i mutanti eterozie sono generalmente rari10. I mutanti omozici o filtranti biallelici possono essere propagati vegetativamente per ottenere materiale sufficiente per l'analisi fenotipica. Poiché l'analisi fenotipica viene eseguita nella generazione T 0, è importante verificare se le linee mutanti potrebbero essere chimeriche. A tal fine, la genotipizzazione deve essere ripetuta su almeno 3 campioni diversi prelevati da ogni linea mutante. Se i risultati della genotipizzazione sono identici tra loro e il campione di genotipizzazione originale (ad esempio, la riga 8 nella Figura 4D), la riga viene mutata omogeneamente e può essere utilizzata per ulteriori analisi. Tuttavia, se i risultati della genotipizzazione differiscono tra campioni indipendenti (ad esempio, la linea 4 nella figura 4D), la linea mutante è chimerica e deve essere scartata.
L'inoculazione di P. andersonii con M. plurifarium BOR2 determina la formazione di noduli di radice (Figura 5). Come si può vedere in Figura 5A, questi noduli sono distribuiti lungo il sistema radice. I noduli di P. andersonii sono di colore marrone chiaro, ma possono essere facilmente discriminati dal tessuto radicale in base alla loro forma (Figura 5B). Esperimenti di inoculazione in vasi e crescita successiva per 4-6 settimane in genere provocare la formazione di 10-30 noduli di dollari (Figura 6A). Un numero simile di noduli è formato dopo l'inoculazione delle piantagioni P. andersonii coltivate a piastra EKM a 4 settimane dopo l'inoculazione (Figura 6A). Nelle sacche, le piantine P. andersonii formano in genere noduli 5-15 a 5 settimane dopo l'inoculazione (Figura 5C-D, 6A). Per analizzare la citoarchitettura a nodulo, i noduli possono essere sezionato e osservato utilizzando la microscopia a campo luminoso. Figura 6B mostra un esempio di una sezione longitudinale attraverso il centro di un nodulo P. andersonii. Questa sezione mostra il fascio vascolare centrale di un nodulo P. andersonii, che è affiancato da lobi noduli contenenti cellule infette (Figura 6B).
Anche le piantine P. andersonii possono essere micorrhizzate. Dopo 6 settimane di inoculazione con R. irregolaris, frequenza di colonizzazione micorrizaina in genere raggiunge > 80% (Figura 6C). A questo punto, generalmente il 30% delle cellule contiene arbuscules (Figura 6C). Un'immagine rappresentativa di un segmento radice P. andersonii contenente arbuscles è illustrata nella Figura 6D.
Figura 1: Immagini rappresentative di un P. andersonii albero, semi e piantine. (A) Albero P. andersonii di sei mesi coltivato in terriccio in una serra condizionata a 28 gradi centigradi. (B) Immagine rappresentativa raffigurante bacche di P. andersonii in varie fasi della maturazione. Le bacche giovani di P. andersonii (non mature) cambieranno colore dal verde al bianco e infine al marrone (maturo) alla maturazione. (C) Semi di P. andersonii incubati su mezzo SH-0 per 1 settimana. Un cerchio nero indica una piantità germinata. (D) Le piantine P. andersonii di quattro settimane coltivate in mezzo SH-0. Le barre della scala sono pari a 25 cm in (A) e 1 cm in (B-D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di espianti nelle diverse fasi della procedura di trasformazione stabile. (A) Explant co-coltivato con A. tumefaciens. (B) Explant overgrown di A. tumefaciens durante le prime 2 settimane dopo la trasformazione. (C) Microcallo transgenico formatosi vicino al sito della ferita di un espianto a 2,5 settimane dopo la co-coltivazione. (D) Immagine rappresentativa di un'espianto a 6 settimane dopo la co-coltivazione che mostra l'emergere di germogli da calli (transgenici). (E) Immagine rappresentativa di un servizio fotografico che diventa biancastro e alla fine muore quando è in contatto diretto con il mezzo contenente kanamicina. Questo scatto è molto probabilmente non transgenico ed evaso nella selezione della kanamicicina quando è collegato all'espianto. (F) Immagine rappresentativa di un espianto trasformato senza successo. (G) Immagine rappresentativa di un espianto trasformato senza successo ricoperto da A. tumefaciens. (H) Singolo germoglio transgenico coltivato su mezzo di propagazione a 8 settimane dopo la co-coltivazione con A. tumefaciens. Le barre della scala sono uguali a 2,5 mm. Le caselle contenenti segni di spunta verdi o croci rosse indicano rispettivamente la trasformazione riuscita o non riuscita dei despighi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di in vitro propagazione. (A) Riprese coltivate su mezzo di propagazione. L'immagine è stata scattata 1 settimana dopo che le piastre sono state aggiornate. (B) Spara coltivato su mezzo di propagazione. L'immagine è stata scattata 4 settimane dopo che le piastre sono state aggiornate. (C) I germogli appena tagliati posizionati sul mezzo di radicamento. (D) Spara incubato su mezzo di radicamento per 2 settimane. Si noti la presenza di radici. Barre della scala sono uguali a 2,5 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi dopo la genotipizzazione delle linee mutanti transgeniche CRISPR/Cas9 di P. andersonii T0. (A) Mappa rappresentativa di un vettore binario utilizzato per la mutagenesi mediata CRISPR/Cas9 di P. andersonii. (B) Risultato rappresentativo dopo la genotipizzazione basata su PCR di potenziali linee mutanti CRISPR/Cas9 utilizzando primer che coprono il sito target dello sgRNA. Mostrato è un'immagine dopo l'elettroforesi gel agarose di amplificatori. I campioni prelevati da singole linee transgeniche sono indicati da numeri. Il tipo selvaggio (WT) e nessun controllo modello (NTC) indicano rispettivamente corsie contenenti controlli positivi e negativi. (C) Rappresentazione schematica degli alleli mutanti ottenuta dopo l'editing genico mediato da CRISPR/Cas9. In colori blu e rosso sono evidenziati rispettivamente nei siti di destinazione del blu e del rosso i siti di destinazione dello sgRNA e le sequenze PAM. (D) Risultato rappresentativo dopo lo screening basato su PCR per potenziali linee mutanti chimeriche. Mostrato è un'immagine dopo l'elettroforesi gel agarose di 3 singoli campioni prelevati dalle linee mutanti 4 e 8. Si noti che la linea 4 mutante transgenica è chimerica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini rappresentative dei saggi di nodulation in piatti e sacchetti. (A) Nodulation su piastre contenenti mezzo EKM solidificato e inoculato con M. plurifarium BOR2 per 4 settimane. (B) Immagine rappresentativa di un nodulo di radice P. andersonii. L'immagine è stata scattata a 4 settimane dopo l'inoculazione con M. plurifarium BOR2. (C) Nodulation in sacchetti contenenti mezzo liquido EKM. Le piantine sono state inoculate con Bradyrhizobium sp. Kelud2A4 per 5 settimane. (D) Immagine rappresentativa di una configurazione completa utilizzata per il nodulation in sacchetti. Le barre di scala sono pari a 2,5 cm in (A,C), 1 mm in (B) e 5 cm in (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati rappresentativi dei saggi di annuizione e micorraria. (A) Grafico a barre rappresentative che mostra il numero di noduli formati per pianta a 4 settimane dopo l'inoculazione con M. plurifarium BOR2 in vasi o su piatti e a 5 settimane dopo l'inoculazione con Bradyrhizobium sp. Kelud2A4 in sacchetti. I dati rappresentano la media : SD (n - 10). (B) Immagine rappresentativa di una sezione longitudinale attraverso un nodulo formato a 4 settimane dopo l'inoculazione con M. plurifarium BOR2. La sezione è macchiata di blu toluidine. (C) Grafico a barre rappresentative che mostra la quantificazione della micorra. Le variabili quantificate secondo Trouvelot et al.29 sono F, la frequenza dei frammenti di radice analizzati che vengono micorrizzati; M, l'intensità dell'infezione; A, l'abbondanza di arbuscules maturi nel sistema radicale totale. La micorrariizzazione è stata quantificata a 6 settimane dopo l'inoculazione con R. irregularis (ceppo DAOM197198). I dati rappresentano la media : SD (n - 10). (D) Immagine rappresentativa degli arbuscules maturi presenti nelle cellule corticali della radice di P. andersonii a 6 settimane dopo l'inoculazione con R. irregolaris. Barre di scala uguali a 75 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
composto | SH-0 | SH-10 | Mezzo di propagazione | Mezzo di radicamento | Mezzo di infiltrazione |
Mezzo sale SH-basal | 3,2 g | 3,2 g | 3,2 g | 3,2 g | 3,2 g |
Miscela SH-vitamina | 1 g | 1 g | 1 g | 1 g | 1 g |
saccarosio | - | 10 g | 20 g | 10 g | 10 g |
BAP (1 mg/mL) | - | - | 1 mL (4,44 m) | - | - |
IBA (1 mg/mL) | - | - | 100 l (0,49 m) | 1 mL (4,92 m) | - |
NAA (1 mg/mL) | - | - | - | 100 l (0,54 M) | - |
1 M MES pH 5,8 | 3 mL | 3 mL | 3 mL | 3 mL | 3 mL |
1 M KOH | Regolare pH a 5,8 | Regolare pH a 5,8 | Regolare pH a 5,8 | Regolare pH a 5,8 | Regolare pH a 5,8 |
Daishin agar | 8 g | - | 8 g | 8 g | - |
Tabella 1: Composizione di30 supporti basati su Schenk-Hildebrandt utilizzati per la crescita delle piantine di P. andersonii, la trasformazione stabile e la propagazione in vitro. Sciogliere i composti solidi in 750 mL di acqua ultra-pura prima di aggiungere scorte liquide. Successivamente, riempire il supporto completo a 1 L. Preparare BAP, IBA, NAA scorte in 0.1 M KOH e memorizzare a -20 oC.
Prima dell'autoclaving: | ||
composto | Importo per litro | Concentrazione finale |
Mannitolo | 5 g | 27,45 mM |
Na-Gluconate | 5 g | 22,92 mM |
Estratto di lievito | 0,5 g | - |
MgSO4X7O2O | 0,2 g | 0,81 mM |
Nacl | 0,1 g | 1,71 mM |
K2HPO4 | 0,5 g | 2,87 mM |
Dopo l'autoclaving: | ||
composto | Importo per litro | Concentrazione finale |
1,5 M CaCl2 | 1 mL | 1,5 mM |
Tabella 2: Composizione del mezzo Yeast-Mannitol (YEM) utilizzato per la coltivazione del rizobio. Regolare il pH a 7,0 e riempire con acqua ultra-pura a 1 L. Per preparare il supporto YEM agar-solidificato, aggiungere 15 g di microagar prima di autoclaving.
Prima dell'autoclaving: | |||
composto | Concentrazione di scorte | Importo per litro medio | Concentrazione finale |
KH2PO4 | 0,44 M | Aggiungi 2 mL | 0,88 mM |
K2HPO4 | 1,03 M | Aggiungi 2 mL | 2,07 mM |
Soluzione di stock di microelementi 500x | - | Aggiungi 2 mL | - |
MES pH 6,6 | 1 M | Aggiungi 3 mL | 3 mM |
Hcl | 1 M | Regolare pH a 6,6 | - |
Acqua ultra-pura | - | Riempire a 990 mL | - |
Dopo l'autoclaving: | |||
composto | Concentrazione di scorte | Importo per litro medio | Concentrazione finale |
MgSO4X7O2O | 1,04 M | 2 mL | 2,08 mM |
Na2SO4 | 0,35 M | 2 mL | 0,70 mM |
NH4NO3 | 0,18 M | 2 mL | 0,36 mM |
CaCl2o 2H2O | 0,75 M | 2 mL | 1,5 mM |
Fe(III)-citrato | 27 mM | 2 mL | 54 M |
Tabella 3: Composizione di 1 L modificato EKM medio31 utilizzato per P. andersonii nodulation assay. La composizione della soluzione stock 500x micro-elementi è elencata nella tabella 4. Per preparare il mezzo EKM solidificato 2%, aggiungere 20 g di Daishin agar prima di autoclaving. Autoclave le scorte di citrate MgSO47H2O, Na2SO4, CaCl2x 2H2O e Fe(III) da sterilizzare. Filtro sterilizzare NH4NO3 soluzione stock per sterilizzare.
composto | Importo per litro | Concentrazione di scorte |
MnSO4 | 500 mg | 3,31 mM |
NSO4x 7H2O | 125 mg | 0,43 mM |
CuSO4x 5H2O | 125 mg | 0,83 mM |
H3BO3 | 125 mg | 2,02 mM |
Na2MoO4o 2H2O | 50 mg | 0,21 mM |
Tabella 4: Composizione della soluzione stock 500x micro-elementi utilizzata per la preparazione del supporto EKM modificato. Conservare la soluzione di stock di microelementi a 4 gradi centigradi.
Composti | Concentrazione di scorte | Importo per litro medio | Concentrazione finale |
K2HPO4 | 20 mM | 1 mL | 0,2 mM |
NH4NO3 | 0,28 M | 10 mL | 2,8 mM |
MGSO4 | 40 mM | 10 mL | 0,4 mM |
K2SO4 | 40 mM | 10 mL | 0,4 mM |
Fe(II)-EDTA | 9 mM | 10 mL | 0,9 mM |
CaCl2 | 80mm | 10 mL | 0,8 mM |
Soluzione di stock di microelementi 50x | - | 10 mL | - |
Tabella 5: Composizione del mezzo 1/2-Hoagland32 utilizzato per i saggi di micorraria. La composizione della soluzione stock 50x microelementi è riportata nella tabella 6. Preparare la soluzione Fe(II)-EDTA combinando FeSO4-7H2O (9 mM) e Na2 EDTA (9 mM) in 1 soluzione di stock, e conservare a 4 gradi centigradi. Regolare il pH del mezzo a 6,1 utilizzando 1 M KOH e riempire con acqua ultra pura a 1 L.
Composti | Importo per litro | Concentrazione di scorte |
H3BO3 | 71,1 mg | 1,15 mM |
MnCl2s4H2O | 44,5 mg | 0,22 mM |
CuSO4x 5H2O | 3,7 mg | 23.18 . |
NCl2 (NCl) | 10,2 mg | 74,84 M |
Na2MoO4o2H2O | 1,2 mg | 4,96 M |
Tabella 6: Composizione della soluzione di stock 50x micro-elementi utilizzata per la preparazione di un mezzo 1/2-Hoagland.
Età degli espianti | Efficienza della trasformazione |
prole di qualcosa | 69,4 x 6,2% (n - 2) |
Maturo | 18,3 x 10,2% (n - 15) |
Tabella 7: Efficienza di trasformazione di P. andersonii. Qui, l'efficienza della trasformazione è definita come la percentuale di espianti che formano almeno 1 callo transgenico o sparare. L'efficienza di trasformazione è stata valutata in 6 settimane dopo la trasformazione ed è rappresentata come media: SD. n indica il numero di esperimenti di trasformazione da cui è stata determinata l'efficienza della trasformazione.
File supplementare 1: Panoramica dei costrutti di livello 1 e livello 2 utilizzati per la mutagenesi CRISPR/Cas9. Fare clic qui per scaricare questo file.
I legumi e il genere Cannabaceae Parasponia rappresentano gli unici due cladi di specie vegetali in grado di stabilire una relazione endosimbiotica con rizobia che fissa l'azoto e formare noduli di radice. Gli studi comparativi tra specie di entrambi i cladi sono altamente rilevanti per fornire informazioni sulle reti genetiche di base che consentono questa simbiosi. Attualmente, gli studi genetici sono fatti principalmente nei legumi; specialmente le due specie modello M. truncatula e L. japonicus. Per fornire una piattaforma sperimentale aggiuntiva e facilitare gli studi comparativi con un nodulante non legume, descriviamo qui un protocollo dettagliato per la trasformazione stabile e le analisi genetiche inverse in P. andersonii. Il protocollo presentato utilizza la propagazione in vitro delle linee T0 transgeniche P. andersonii, consentendo l'avvio dell'analisi fenotipica entro 4 mesi dalla co-coltivazione A. tumefaciens. Questo è sostanzialmente più veloce rispetto ai protocolli attuali che sono stati stabiliti per la trasformazione stabile dei legumi33. Questo rende P. andersonii un modello di ricerca attraente.
Il protocollo descritto di seguito contiene diversi passaggi critici. Il primo dei quali riguarda la germinazione dei semi. Per preparare i semi di P. andersonii per la germinazione, i semi devono essere isolati dalle bacche. Questo viene fatto strofinando le bacche su un pezzo di carta velina o contro l'interno di un setaccio di tè. Questa procedura deve essere eseguita delicatamente per evitare danni al cappotto di semi. Se il mantello del seme viene danneggiato, la candeggina potrebbe entrare nel seme durante la sterilizzazione, riducendo la vitalità del seme. Per rompere la dormancy dei semi, i semi sono sottoposti a un ciclo di temperatura di 10 giorni. Tuttavia, nonostante questo trattamento, la germinazione non è completamente sincronizzata. Generalmente, i primi semi mostrano l'emergere del radicolo dopo 7 giorni, ma altri potrebbero richiedere diversi giorni in più per germinare.
I punti critici della procedura di trasformazione riguardano la scelta del materiale di partenza e la durata della fase di co-coltivazione. Per raggiungere una trasformazione efficiente, è meglio utilizzare steli sani e giovani o piccioli di piante coltivate in serra non sterili come materiale di partenza. Al fine di indurre la crescita di rami giovani, si consiglia di tagliare gli alberi Parasponia ogni 2-3 mesi e rinfrescare gli alberi una volta all'anno. Inoltre, la fase di co-coltivazione deve essere eseguita solo per 2 giorni. La co-coltivazione prolungata promuove l'eccessiva colonizzazione degli espianti tissutali da parte di A. tumefaciens e generalmente riduce l'efficienza di trasformazione. Per evitare l'eccessiva colonizzazione di A. tumefaciens è anche importante aggiornare regolarmente le piastre su cui vengono coltivati gli espianti. Nel caso in cui si verifichi una colonizzazione eccessiva, gli espianti tissutali potrebbero essere lavati (vedi Sezione 3.8) per rimuovere le cellule A. tumefaciens. Si consiglia di aggiungere candeggina alla soluzione SH-10 utilizzata per il lavaggio (concentrazione finale: ipocloreto del 2%). È importante notare che questa fase di lavaggio aggiuntiva potrebbe non funzionare su espianti fortemente infetti (Figura 2B). Nel caso in cui una trasformazione con un costrutto CRISPR/Cas9 produca solo un numero limitato di germogli con trasformazione putativa o se si prevede che la mutagenesi di un particolare gene causi problemi di rigenerazione, si consiglia di includere un costrutto di controllo vettoriale vuoto come il controllo positivo. Infine, è importante assicurarsi che tutte le linee transgeniche selezionate siano risultanti da eventi indipendenti di integrazione T-DNA. Pertanto, istruiamo a prendere solo un singolo germoglio putativamente transgenico da ogni lato di un eximpianto. Tuttavia, ci rendiamo conto che questo riduce il numero potenziale di linee indipendenti. Se sono necessarie molte linee, i ricercatori potrebbero decidere di separare calli formati in modo putativo dagli espianti originali quando questi calli hanno dimensioni e coltura di 2 mm in modo indipendente. In questo modo, più linee potrebbero essere isolate da ogni espianto, il che aumenta il numero di potenziali linee transgeniche.
Nel protocollo attuale, le linee transgeniche di P. andersonii vengono propagate vegetativamente attraverso la propagazione in vitro. Il vantaggio di questo è che molte pitole transgeniche possono essere generate in un periodo di tempo relativamente breve. Tuttavia, questo metodo ha anche diverse limitazioni. In primo luogo, il mantenimento delle linee transgeniche T0 attraverso la propagazione in vitro è laborioso e potrebbe provocare alterazioni genetiche o epigenetiche indesiderate34,35. In secondo luogo, le linee T0 contengono ancora una copia del T-DNA, compresa la cassetta di resistenza agli antibiotici. Questo limita il numero di possibili ritrasformazioni, poiché sono necessari marcatori di selezione diversi per ogni ritrasformazione. Attualmente, abbiamo testato la trasformazione solo utilizzando la kanamycin o la selezione dell'igromicina (dati non mostrati). Inoltre, la presenza della sequenza di codifica Cas9 e degli sgRNA nelle linee transgeniche T0 complica gli studi di complemento. I saggi di complemento sono possibili, ma richiedono che i siti di destinazione dello sgRNA siano mutati in quanto tale che sia impedito l'editing genico del costrutto di complemento. In terzo luogo, uno svantaggio di lavorare con le linee T0 è che i mutanti CRISPR/Cas9 potrebbero essere chimerici. Per prevenire l'analisi fenotipica delle linee mutanti chimetriche, si consiglia di ripetere l'analisi della genotipizzazione dopo la propagazione in vitro su almeno 3 diversi germogli. Anche se, il numero di mutanti chimerici ottenuti utilizzando il protocollo qui descritto è limitato, sono occasionalmente osservati10. Per superare i limiti di lavoro con le linee T 0, le linee mutanti P. andersonii potrebbero essere propagate generativamente. P. andersonii alberi sono dioecious e vento impollinato2. Ciò significa che ogni linea transgenica deve essere manipolata in modo tale che i fiori maschili e femminili siano prodotti su un singolo individuo e successivamente coltivati come tali che l'impollinazione incrociata non si verifichi. Poiché P. andersonii è un albero in rapida crescita, richiede una notevole quantità di spazio in una serra tropicale (28 , 85% di umidità relativa). Pertanto, anche se tecnicamente possibile, la propagazione generativa delle linee transgeniche P. andersonii è logisticamente impegnativa.
Nella sezione protocollo, abbiamo descritto 3 metodi per annuificare P. andersonii. Il vantaggio dei sistemi a piastre e sacca è che le radici sono facilmente accessibili, il che può consentire l'inoculazione spot dei batteri e seguire la formazione di noduli nel tempo. Tuttavia, il sistema di piastre è piuttosto laborioso, il che lo rende meno adatto per esperimenti di nodulation su larga scala. Uno svantaggio del sistema della sacca è che è difficile prevenire la contaminazione fungina. I sacchetti non sono sterili, e quindi la crescita fungina è spesso osservata nella metà superiore della sacca. Tuttavia, questo non influisce sulla crescita di P. andersonii, e quindi non interferisce con i saggi di annuizione. Inoltre, il sistema della sacca è adatto solo per piantine. Nonostante diversi tentativi, non siamo stati in grado di coltivare le piantine ottenute attraverso la propagazione in vitro nelle sacche.
La pipeline di genetica inversa P. andersonii descritta qui offre un miglioramento sostanzialerispetto al metodo di trasformazione delle radici basato su A. rhizogenes11 . Utilizzando le procedure descritte, le linee transgeniche stabili possono essere generate in modo efficiente e possono essere mantenute tramite la propagazione in vitro. Al contrario, la trasformazione di A. rhizogenes è transitoria e si traduce solo nella formazione di radici transgeniche. Poiché ogni radice transgenica deriva da una trasformazione indipendente, i saggi basati sulla trasformazione di A. rhizogenes soffrono di una sostanziale variazione fenotipica. Questa variazione è molto meno in caso di linee stabili, anche se la propagazione in vitro crea anche un certo livello di variazione. A causa di questa variazione ridotta e del fatto che più piastrine potrebbero essere fenotitizzate per ogni linea stabile, le linee stabili sono più adatte per i saggi quantitativi rispetto alle radici trasformate da A. rhizogenes. Inoltre, la trasformazione stabile non dipende dall'introduzione del locus che induce la radice di A. rhizogenes (rol) che colpisce l'equilibrio ormonale endogeno15. Pertanto, linee stabili sono più adatte per l'analisi genetica inversa dei geni coinvolti nell'omeostasi ormonale rispetto alle radici trasformate da A. rhizogenes. Un vantaggio più generale di P. andersonii come modello di ricerca è che non ha sperimentato una recente duplicazione dell'intero genoma (WGD). La sottofamiglia legume Papilionobiasi, che comprende il modello legumi M. truncatula e L. japonicus, così come il Salicaceae (ordine Malpighiales) che comprende l'albero modello Populus trichocarpa sperimentato WGDs 65 milioni di anni fa36,37. Molte copie geniche paralose risultanti da questi WGD sono conservate nei genomi di M. truncatula, L. japonicus e P. trichocarpa37,38,39, che crea ridondanza che potrebbe complicare le analisi genetiche inverse. Poiché P. andersonii non ha sperimentato un recente WGD, le analisi genetiche inverse su P. andersonii potrebbero essere meno influenzate dal funzionamento ridondante delle copie del gene paraloso.
Nel loro insieme, forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi genetica inversa in P. andersonii. Utilizzando questo protocollo, singole linee mutanti possono essere generate in modo efficiente in un lasso di tempo di 2-3 mesi10. Questo protocollo può essere esteso per creare mutanti di ordine superiore attraverso il multiplexing di sgRNA che prendono di mira diversi geni contemporaneamente, come mostrato per altre specie vegetali40,41,42. Inoltre, la procedura di trasformazione stabile qui descritta non si limita al targeting genico CRISPR/Cas9, ma potrebbe anche essere utilizzata per introdurre altri tipi di costrutti (ad esempio, per i saggi promotore-reporter, espressione ectopica o trans- complementari). Abbiamo stabilito P. andersonii come un modello di ricerca comparativa per studiare simbiosi mutualistici con rizobia che fissa l'azoto o funghi endomycorrizal. Tuttavia, i protocolli qui descritti forniscono anche strumenti per studiare altri aspetti della biologia di questo albero tropicale, come la formazione del legno, lo sviluppo di fiori bisessuali o la biosintesi dei metaboliti secondari specifici di Cannabaceae.
Gli autori amano riconoscere Mark Youles, Sophien Kamoun e Sylvestre Marillonnet per aver reso disponibili le parti di clonazione di Golden Gate attraverso il database Addgene. Inoltre, vorremmo ringraziare E. James, P. Hadobas e T. J. Higgens per i semi di P. andersonii. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-VICI grant 865.13.001; NWO-Open Competition grant 819.01.007) e il Ministero della Ricerca, tecnologia e istruzione superiore della Repubblica d'Indonesia (riSET-PRO grant 8245-ID).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sigma-Aldrich | N0640 | NAA | |
Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES | |
Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone | |
Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal | |
Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel | |
- | - | Pouches box material, hangers | |
Merck | 101188 | NH4NO3 | |
Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP | |
Merck | 100156 | H3BO3 | |
Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly | |
Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly | |
Merck | 137101 | CaCl2·2H2O | |
Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na | |
Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure | |
Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay | |
Merck | 102790 | CuSO4·5H2O | |
Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium | |
Merck | 105101 | K2HPO4 | |
VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA | |
Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 | |
Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly | |
Merck | 100983 | C2H5OH | |
VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA | |
Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane | |
Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs | |
Mega International | - | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ | |
Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues | |
VWR Chemicals | 24385.295 | - | |
Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part | |
Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding | |
Merck | 100317 | HCl | |
Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA | |
Merck | 103862 | C6H5FeO7 | |
Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O | |
Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG | |
Duchefa Biochemie | K0126.0010 | ||
Sigma-Aldrich | L2000 | ||
Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O | |
Merck | 105934 | MnCl2·4H2O | |
Merck | 102786 | MnSO4O | |
Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium | |
Manutan | 92007687 | Pouches material | |
Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil | |
Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay | |
VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes | |
Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines | |
Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) | |
Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor | |
Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor | |
Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation | |
Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation | |
Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) | |
Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module | |
Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module | |
Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette | |
Topzeven | - | Used as filters for washing spore suspension | |
Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 | |
Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings | |
Merck | 104871 | KH2PO4 | |
Merck | 105033 | KOH | |
Merck | 105153 | K2SO4O | |
Van Leusden b.v. | - | Used as growing substrate for mychorrhization assay | |
Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium | |
Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture | |
Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation | |
Merck | 137017 | NaCl | |
VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 | |
Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O | |
Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O | |
Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O | |
Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O | |
Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 | |
Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly | |
Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly | |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder | |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution | |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution | |
Merck | 1159300025 | ||
Acros | 189350250 | ||
VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 | |
Stout Perspex | - | pouches box material, lid | |
Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | ||
Merck | 108816 | ZnCl2 | |
Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |
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