Lentiviral CRISPR/Cas9-medierad genom redigering för studiet av hematopoietiska celler i sjukdomsmodeller

Manipulera gener i hematopoietiska stamceller med hjälp av konventionella transgenetik metoder kan vara tidskrävande, dyrt och utmanande. Dra nytta av framsteg i genom redigering teknik och lentivirus-medierade transgenens leveranssystem, en effektiv och ekonomisk metod beskrivs här som etablerar möss där gener manipuleras specifikt i hematopoietiska stamceller. Lentivirus används för att transduce Cas9-uttrycker härstamning-negativa benmärgsceller med en guide RNA (gRNA) inriktning på specifika gener och en röd fluorescens reporter gen (RFP), då dessa celler transplanteras till lethally-bestrålade C57BL/6 möss. Möss som transplanteras med lentivirus som uttrycker icke-riktad gRNA används som kontroller. Engrafering av sensorik hematopoietiska stamceller utvärderas genom flödescytometrisk analys av RFP-positiva leukocyter av perifert blod. Med denna metod, ~ 90% transduktion av myeloida celler och ~ 70% av lymfoida celler vid 4 veckor efter transplantation kan uppnås. Genomiskt DNA isoleras från RFP-positiva blodceller, och delar av det riktade DNA-området förstärks av PCR för att validera genomedigering. Detta protokoll ger en hög genomströmning utvärdering av hematopoies-reglerande gener och kan utvidgas till en mängd olika modeller mus sjukdom med hematopoietisk cell inblandning.