Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

I nucleotidi mitocondriali sono particelle compatte formate da molecole di DNA mitocondriale rivestite di proteine. Il DNA mitocondriale codifica tRNA, rRNA e diversi polipeptidi mitocondriali essenziali. I nucleoidi mitocondriali si dividono e si distribuiscono all'interno della rete mitocondriale dinamica che subisce fissione/fusione e altri cambiamenti morfologici. La microscopia a fluorescenza dal vivo ad alta risoluzione è una tecnica semplice per caratterizzare la posizione e il movimento di un nucleoide. Per questa tecnica, i nucleoidi sono comunemente etichettati attraverso tag fluorescenti dei loro componenti proteici, vale a dire il fattore di trascrizione a (TFAM). Tuttavia, questa strategia ha bisogno di sovraespressione di un costrutto fluorescente con tag proteico, che può causare artefatti (riportati per TFAM) e non è fattibile in molti casi. I coloranti organici che legano il DNA non presentano questi svantaggi. Tuttavia, mostrano sempre una colorazione dei DNA nucleari e mitocondriali, mancando quindi di specificità ai nucleoidi mitocondriali. Tenendo conto delle proprietà fisico-chimiche di tali coloranti, abbiamo selezionato una macchia di gel acido nucleico (SYBR Gold) e ottenuto l'etichettatura preferenziale dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive. Le proprietà del colorante, in particolare la sua elevata luminosità dopo il legame al DNA, permettono la successiva quantificazione del movimento nucleoideto mitocondriale utilizzando serie temporali di immagini di illuminazione strutturata super-risoluzione.