Fält Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test för resursbegränsade inställningar med ytterligare molekylära tillämpningar

Summary

Vi presenterar ett komplett protokoll för postmortem diagnos av animaliska rabies under fältförhållanden med hjälp av en snabb immunochromatographic diagnostiska test (RIDT), från hjärnan biopsi provtagning till slutlig tolkning. Vi beskriver också ytterligare tillämpningar med hjälp av enheten för molekylär analys och viral genotypning.

Abstract

Funktionella rabiesövervakningssystem är avgörande för att tillhandahålla tillförlitliga uppgifter och öka det politiska engagemang som krävs för sjukdomsbekämpning. Hittills måste djur som misstänks vara rabiespositiva lämnas in till en postmortembekräftelse med hjälp av klassiska eller molekylära laboratoriemetoder. De flesta endemiska områden finns dock i låg- och medelinkomstländer där djur rabiesdiagnos är begränsad till centrala veterinärlaboratorier. Dålig tillgång till övervakningsinfrastruktur leder till att allvarliga sjukdomar underrapporterar från avlägsna områden. Flera diagnostiska protokoll som kräver låg teknisk expertis har nyligen utvecklats, vilket ger möjlighet att etablera rabies diagnos i decentraliserade laboratorier. Vi presenterar här ett komplett protokoll för fält postmortem diagnos av animaliska rabies med hjälp av en snabb immunochromatographic diagnostiska test (RIDT), från hjärnan biopsi provtagning till den slutliga tolkningen. Vi avslutar protokollet genom att beskriva en ytterligare användning av enheten för molekylär analys och viral genotypning. RIDT upptäcker lätt rabiesvirus och andra lyssavirus i hjärnprover. Principen för sådana tester är enkel: hjärnmaterial appliceras på en testremsa där guldkonjugerade antikroppar binder specifikt till rabiesantigener. Antigen-antikroppskomplexen binder ytterligare till fasta antikroppar på testlinjen, vilket resulterar i en tydligt synlig lila linje. Viruset är inaktiverat i testremsan, men virus-RNA kan extraheras senare. Detta gör att testremsan, snarare än det smittsamma hjärnprovet, kan skickas säkert och enkelt till ett utrustat laboratorium för bekräftelse och molekylär typning. Baserat på en modifiering av tillverkarens protokoll fann vi ökad testkänslighet och nådde 98% jämfört med guldstandardreferensmetoden, det direkta immunofluorescensantikroppstestet. Fördelarna med testet är många: snabb, lätt att använda, låg kostnad och inga krav på laboratorieinfrastruktur, såsom mikroskopi eller kall-kedjan överensstämmelse. RIDTs representerar ett användbart alternativ för områden där referensdiagnostiska metoder inte är tillgängliga.

Introduction

Hund rabies är den främsta orsaken till mänskliga rabies, globalt ansvarig för cirka 59.000 dödsfall per år, nästan alla förekommer i låg-och medelinkomstländer (LMIC) i Asien och Afrika¹. Det huvudsakliga etiologiska medlet är ett neurotropt hundsubventasocierade klassiska rabiesvirus (RABV, familjen Rhabdoviridae,släktet Lyssavirus,arter Rabies lyssavirus). Men andra rabiesrelaterade lyssavirus, som främst cirkulerar i fladdermusarter, orsakar också sjukdom^2,3. I drabbade regioner hindras ofta sjukdomsövervakning och sjukdomsbekämpning av politiskt engagemang på låg nivå som sannolikt beror på brist på tillförlitliga uppgifter^4,,5,,6. En orsak till sjukdomsunderrapportering är frånvaron av laboratoriediagnos, delvis på grund av begränsad tillgång till utrustade laboratorier och utbildad personal samt svårigheterna med transport av exemplaren. Laboratoriediagnos är nödvändigt för att bekräfta rabies fall och dessutom möjliggör genetisk karakterisering av de inblandade stammarna, vilket ger insikt om virusöverföring på regional nivå^4,5,7.

De nuvarande guldstandarderna för diagnos av rabies efter döden, som godkänts av både Världshälsoorganisationen (WHO) och Världsorganisationen för djurhälsa (OIE), är det direkta fluorescerande antikroppstestet (DFAT), det direkta snabba immunohistokemitestet (DRIT) och molekylära metoder (t.ex. omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR))^4,8. Korrekt tillämpning i LMIC är dock fortfarande begränsad på grund av otillräckliga laboratorieanläggningar med inkonsekvent strömförsörjning, okyld provtransport och brist på kvalitetsledningssystem. Eftersom djur rabiesdiagnos vanligtvis endast utförs vid centrala veterinärlaboratorier i LMIC, återspeglar befintliga övervakningsdata huvudsakligen rabiessituationen i stadsområden.

Nyligen utvecklade lågteknologiska diagnostiska alternativ erbjuder möjligheter att etablera rabiesdiagnos i avlägsna områden och decentraliserade rabieslaboratorier^4,,8,9. Det snabba immunokromatografiska diagnostiska testet (RIDT) är ett lateralt flödestest baserat på immunokromatografi med hjälp av guldkonjugerade detektorantikroppar och är ett mycket lovande rabiesdiagnostiskt verktyg^10,,11,12,13. Principen är enkel: efter utspädning blandas hjärnmaterialet i den medföljande bufferten, och några droppar appliceras på testremsan där guldkonjugerade monoklonala antikroppar binder specifikt till rabiesantigener, främst nukleoproteinerna (figur 1). Antigen-antikroppskomplexen genomgår sedan sidoflödesmigration, bindande vid testlinjen (T-line) till fasta antikroppar mot rabiesantigener, vilket resulterar i en tydligt synlig lila linje. De återstående guldkonjugerade antikropparna som inte är bundna till rabiesantigener fortsätter att migrera och fixera till membranet genom ytterligare riktade antikroppar, vilket resulterar i en tydligt synlig lila kontrolllinje (C-line).

Enstegs, låg kostnad metoden är snabb, extremt lätt och kräver inte dyr utrustning eller speciella lagringsförhållanden. Med modifiering av tillverkarens protokoll för att eliminera utspädningssteget ingår nästan all utrustning och reagens som krävs för att utföra testet i^{sats 14}. Resultatet läss efter 5-10 minuter utan mikroskop. Detta är en stor fördel jämfört med DFAT-testet, som kräver ett fluorescensmikroskop och konjugat för immunfluorescens, tillsammans med kyld transport och provlagring. Även DRIT-testet, som kan utföras med hjälp av ett lätt mikroskop, kräver en kontinuerlig kylkedja för att lagra anti-rabies antikroppar, som ännu inte är kommersiellt tillgängliga. I jämförelse med drit kräver RIDT inga giftiga kemikalier, en särskild fördel i länder där avfallshanteringen är dåligt reglerad. Det snabba testet är mindre tidskrävande med mycket enklare tolkning jämfört med guldstandardtesterna DFAT och DRIT. Detta möjliggör testning på plats av personal med begränsad teknisk expertis.

Baserat på dessa testegenskaper, snabb diagnos av misstänkta djur i avlägsna områden blir genomförbart, underlätta genomförandet av efter exponering profylax (PEP) för utsatta människor så snart som möjligt. Dessutom är avståndstransport av rabiesprover inte nödvändigt, vilket resulterar i bättre provkvalitet vid tidpunkten för provningen. De resultat som erhålls med RIDT-testerna bör dock för närvarande bekräftas med hjälp av ett referensdiagnostiskt test som DFAT eller DRIT.

RIDT-tekniker för detektion av RABV och andra lyssavirus har utvärderats. En av de första studierna genomfördes av koreanska forskare i 2007¹⁰. Jämfört med DFAT-metoden visade RIDT i 51 djurprover och 4 RABV-isolat en känslighet och specificitet på 91,7 % respektive 100 %. Dessa resultat bekräftades senare med 110 djurhjärnprover från Korea, med känslighet och specificitet, jämfört med DFAT, på 95% och 98,9%,^{respektive 15}. På senare tid har andra studier utvärderat prestandan hos denna RIDT med hjälp av virusisolat och/eller infekterade hjärnprover från olika djur med olika geografiska ursprung. En panel med 21 prover, inklusive afrikanska RABV och andra afrikanska lyssavirus (Duvenhage virus (DUVV), Lagos bat virus (LBV) och Mokola virus (MOKV)), upptäcktes framgångsrikt, med känslighet på 100% jämfört med DFAT¹⁶. Liknande hög känslighet (96.5%) och specificitet (100%) värden erhölls från en panel med 115 hjärnprover från Etiopien¹⁷. En annan studie utvärderade europeiska RABV isolat, två andra europeiska lyssavirus (Europeiska bat lyssavirus typ 1 (EBLV-1) och typ 2 (EBLV-2)), och den australiska bat lyssavirus (ABLV)¹⁸. Baserat på analys av 172 djurhjärnprover hade RIDT-satsen 88,3 % känslighet och 100% specificitet jämfört med DFAT, och de tre rabiesrelaterade lyssavirusen upptäcktes framgångsrikt. I denna studie, några av de falska negativa resultaten kom från hjärnan prover lagras i glycerol buffert, vilket tyder på att felaktig glycerol borttagning påverkat kapillär flöde eller antikroppar bindande. En färsk analys av 43 kliniska prover från australiska fladdermöss bekräftade tidigare testresultat, med fullständig överensstämmelse med DFAT¹⁹. Två studier genomfördes i Indien med hjälp av RIDT på ett begränsat antal kliniska prover (11 och 34 prover). Jämfört med DFAT var känsligheten mellan 85,7 % och 91,7 % och specificiteten var 100 %^20,21. En annan utvärdering av detta kit med 80 djurhjärnprover från Afrika, Europa och Mellanöstern fick fullständig konkordans med DFAT för specificitet (100%) men en högre känslighet (96,9%) jämfört med tidigare studier²². I en nyligen inter-laboratorium jämförelse av denna RIDT utförs i 22 olika laboratorier med hjälp av en panel av 10 prover, var den totala konkordansen 99,5%²³.

Endast en nyligen multicentrisk studie visade otillfredsställande övergripande RIDT prestanda²⁴. Prover från tre olika datamängder testades och gav variabla känslighets- och specificitetsvärden jämfört med DFAT. Till exempel gav känslighet och specificitet som erhållits med den första panelen (n=51) och den andra panelen (n=31) av prover från försöksinfekterade djur, alla testade i laboratorie A, en känslighet på 16% respektive 43%, medan specificiteten var 100% för båda. Omvänt gav resultaten av den tredje panelen (n=30) av fältkliniska prover som analyserades av laboratorium B en fullständig överensstämmelse med resultaten av DFAT, vilket ytterligare nästan helt bekräftades av laboratoriet A (85% känslighet och 100% specificitet). Variation mellan parti och parti föreslogs som en möjlig förklaring till den fluktuerande relativt låga känsligheten med RIDT²⁴.

Samtidigt genomförde en annan studie en liknande valideringsprocess av ovan beskrivna RIDT, med en modifiering av tillverkarens rekommenderade protokoll¹⁴. För utspädning steg (1:10) i PBS utelämnades under beredning av hjärnan materialet. Baserat på detta enklare modifierade protokoll erhöll författarna känslighet och specificitet på 95,3% respektive 93,3 %, jämfört med DFAT genom att under laboratorieförhållanden testa en datauppsättning av 73 djurhjärnprover, naturligt eller experimentellt infekterade med olika RABV-stammar. Studien presenterade den första utvärderingen av denna RIDT i en fältmiljö (Tchad, Afrika). I 48 kliniska hjärnprover var känslighet och specificitet 94,4% respektive 100%. Skillnaderna mellan DFAT och RIDT berodde på falska positiva resultat med DFAT, bestäms efter bekräftelse med RT-PCR. När dessa resultat togs bort, det fanns fullständig konkordans, och det visade att RIDT var mer tillförlitlig att DFAT under dessa fältförhållanden¹⁴. Ingen batch-till-batch-variant observerades med det ändrade protokollet. När det ändrade protokollet tillämpades på ett litet antal av DFAT/ RIDT-divergentproverna (n=8) i studien av Eggerbauer et al.^24,hittades alla samstämmiga (100 % känsliga).

En annan stor fördel med RIDT är sekundär användning för att upptäcka virus-RNA fast på remsan med hjälp av molekylära tekniker (såsom RT-PCR) och efterföljande genotypning^14,24. Efter ett extraktionssteg visade Léchennes et al.¹⁴ virus-RNA som fixerats på Anigen-enhetens membran med RT-PCR med 86,3 % känslighet i en panel med 51 prover (inklusive 18 prover som testats och levererats från Tchad vid rumstemperatur). Efterföljande genotypning var möjlig i 93% av de 14 prover som testades. Sanger sekvensering av PCR-amplicons av minst 500 nukleotider i längd användes. Förutom RABV isolat, testet upptäcktes fyra andra lyssavirus arter, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 och Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), under en helt samstämmig internationell inter laboratorietest¹⁴. Känsligheten för viral RNA-detektering var ännu högre (100%) i studien av Eggerbauer et al., baserat på laboratorieprovundersökning²⁴. Den senare studien visade också att den buffert som användes i RIDT-satsen inaktiverat virus. Därmed kan enheterna levereras enkelt, vid omgivningstemperatur utan särskilda försiktighetsåtgärder för biosäkerhet till referenslaboratorier, för molekylär bekräftelse och genotypning.

Baserat på tidigare utvärderingar erbjuder RIDT-verktyg många fördelar för användning i fältinställningar, särskilt när referensdiagnostikteknikerna inte är tillgängliga. Detta test har dock också vissa begränsningar, särskilt låg känslighet för antigendetektering^14,24. Testet gäller för prover som innehåller stora mängder virusantigener, såsom hjärnprover. Det är dock inte lämpligt för andra prover såsom saliv eller andra kroppsvätskor. En annan nackdel är kostnaden för enheten (cirka 5-10 euro i Europa), vilket är billigare jämfört med kostnaden för att utföra DFAT, RT-PCR eller DRIT, men som fortfarande är hög för LMIC. Framtida utveckling och validering av liknande RIDT-enheter från andra företag kan dock leda till en prissänkning. En studie rapporterade batch-to-batch variationer. Även om det inte rapporteras av andra, bör strikta kvalitetskontroller ändå utföras vid testning av ett nytt parti, som för alla reagenser som används i en kvalitetsledningsmiljö. Användningen av det ändrade protokollet ändrades inte när olika batchar¹⁴användes . Alla utom en studie visade att känsligheten hos RDIT var hög jämfört med DFAT (cirka 90%-95%). Eftersom rabies alltid är dödligt rekommenderas det fortfarande starkt att bekräfta eventuella negativa resultat med RDIT med hjälp av ett referensdiagnostiskt test som DFAT, DRIT eller RT-PCR¹⁴.

I detta manuskript presenterar vi ett komplett protokoll för fält postmortem diagnos av animaliska rabies baserat på ett exempel på en kommersialiserad RIDT, från hjärnan prov insamling till tillämpning av ett ändrat protokoll jämfört med tillverkaren rekommendationer (som tidigare validerats¹⁴) och efterföljande molekylär analys. Detta protokoll tillämpades och validerades många gånger under fältförhållanden i väst- och centralafrika, där RIDT användes rutinmässigt för rabiesdiagnos vid sidan av DFAT-testet. Vi visar dessutom en andra applikation för enheten, i laboratorieinställningar, för extrahering och detektion med RT-PCR av virus-RNA fast på enheten.

Protocol

1. Provsamling via foramenmagnum (occipitalrutt)²⁵

OBS: Denna teknik kan implementeras under laboratorieförhållanden eller i fältinställningar. Proverna bör bearbetas så snart som möjligt efter det misstänkta djurets död eller förvaras vid kall temperatur (kyld eller fryst, om möjligt) för att undvika nedbrytning som kan påverka resultaten. I likhet med andra referenstekniker baserade på lyssavirusantigener som detektion av DFAT och DRIT, bör förmultna prover inte testas eftersom det kan påverka resultatet (risk för falskt negativt resultat).

VARNING: Alla prover bör betraktas som potentiellt smittsamma. Säkerhetsföreskrifter och säkerhetsrutiner bör följas strikt, även i fältinställningar⁴. I synnerhet bära lämplig personlig skyddsutrustning inklusive mask, glasögon, handskar och en labbrock. Använd lämpligt desinfektionsmedel för material- och provdekontaminering (t.ex. natriumhypoklorit med rekommenderade tillverkarutspädningar, 70 % alkohol - etanol eller isopropanol, 1 % tvållösning). All personal som hanterar prover bör vaccineras mot rabies.

1. Ta bort djurhuvudet med en kniv innan den första halskotan (atlaskotan) för att komma åt foramenmagnum.
   OBS: Undvik att använda en manuell såg eller liknande verktyg för att minimera den smittsamma aerosolen.
2. Samla upp hjärnstammen (medulla oblongata) med en engångsplastpipette (figur 2A), ett drickshalm ( figur2B),en klämma (figur 2C) eller en dropper (medföljer RIDT) (figur 2D).
   OBS: Särskild uppmärksamhet måste ägnas vid insamling av provet, eftersom det är ett mycket viktigt steg för tillförlitligheten av resultaten. Förutom den tillhörande video som visar på ett enkelt sätt hur man samlar den del av hjärnstammen av intresse, är ett träningssteg rekommenderas starkt för att se till att samla in rätt anatomiska avsnitt.
3. Alternativt och tillsats av hjärnstammen (medulla oblongata), samla andra delar av hjärnstammen eller hjärnan (lillhjärnan, hippocampus, thalamus och cortex) med samma occipital väg genom att trycka och rotera plast pipett eller halm mot ögonhålan (Figur 3).
4. Om du använder ett sugrör eller pipett, tryck försiktigt fast det för att deponera hjärnprovet (0,5-2 g) i ett rör för efterföljande analys och/eller biobankning.
   OBS: Provlagring i glycerol rekommenderas inte, eftersom det verkar påverka kapillärflödet eller antikroppsbindningssteget i RIDT¹⁸.

2. Utförande av det ändrade RIDT-protokollet¹⁴

OBS: Denna ändring utelämnar ett utspädningssteg (1:10) i PBS, enligt vad som anges i tillverkarens protokoll (alla versioner), och kan implementeras under laboratorie- eller fältinställningar.

1. Använd svabben/droppern för att samla in motsvarande en halv jordnöt eller ärt (0,1-0,5 g) av hjärnmaterial och placera den i buffertprovröret.
   Obs: För det ändrade protokollet ingår alla reagenser/förbrukningsvaror i satsen (ingen PBS eller ytterligare rör behövs) (figur 4). Dokumentera batchnumret för satsen och kontrollera giltigheten av utgångsdatumet.
2. Krossa försiktigt hjärnmaterialet direkt i röret med svabben eller dropparen i ca 30 s tills en homogen suspension erhålls.
   OBS: Buffertreaktionen inaktiverar virusets smittsamhet under villkoren i tillverkarens protokoll²⁴.
3. Använd dropparen, sätt in fyra droppar (ca 100 μL) av suspensionen i provinloppet på testanordningen.
4. Vänta på fullständig provmigrering (1-5 min) innan du läser testenheten. Migrationen bör påbörjas snabbt efter deponering av provet (1-5 min).
5. Vid fördröjning (på grund av hög viskositetsfjädring) eller för att påskynda migrationens början, skrapa försiktigt botten av enhetens insättningsplats med dropparen (1-5 gånger) och tillsätt så småningom 1-2 droppar till. Migrationen bör påbörjas omedelbart därefter.
6. Läs testresultatet i detektionsfönstret efter 5-10 min och högst 20 min, efter migreringens.
7. Tolka resultatet baserat på närvaron eller frånvaron av manöverledningen (C-linjen) och testlinjen (T-line) (lila linjer) i detekteringsfönstret, enligt figur 5. Tänk på provet positivt när två rader är synliga (figur 5A), negativt om endast C-linjen finns ( figur5B) och ogiltig om endast T-linjen finns eller om inga linjer är synliga ( figur5C).
   Ogiltiga resultat bör upprepas minst en gång. Andra tekniker bör utföras om resultaten förblir ogiltiga. Negativa resultat som erhållits med RIDT måste därefter bekräftas med hjälp av en guldstandard referensmetod, som DFAT, DRIT och molekylära metoder (polymeras kedjereaktion eller PCR). Även om känsligheten för detta test är hög (se representativa resultat), är det inte 100%.
8. Förvara använda enheter i rumstemperatur, eller kyla/frysa när det är möjligt, för efterföljande molekylär analys (se avsnitt 4). Frys den återstående provupphängningen vid -20 °C/-80 °C i buffertröret för att vid behov upprepa testet eller för efterföljande molekylär analys.

3. RNA-extraktion och detektion av RT-qPCR från RIDT-enheten

OBS: Detta steg kan endast genomföras under laboratorieförhållanden med anpassad miljö och lämplig utrustning för molekylär diagnos. Det kan göras strax efter RIDT-testet eller retroaktivt på arkiverade RIDT-enheter, förvaras i rumstemperatur (15-30 °C), kylda eller frysta.

1. RNA-extraktion
   OBS: För att övervaka extraktionssteget rekommenderas att använda en intern kontroll som kan vara ett endogent mRNA (t.ex. ß-aktin) eller en exogen kontroll (t.ex. syntetisk RNA för eGFP) som spikas direkt i provet under de första stegen i extraktionen^26,,27.
   1. Öppna försiktigt enheten och ta bort filterpapperet.
   2. Kapa provets deponeringsområde och placera det i ett rör som innehåller 1 ml tri-reagens LS. Inkubera på RT i 1 timme med mild regelbunden manuell omrörning.
   3. Utför extraktionen i enlighet med tillverkarens rekommendationer enligt tidigare beskrivna²⁷. I detta steg kan den exogena interna kontrollen läggas till.
   4. Under processen, tillsätt 2 μL glykogen för att underlätta utfällning av RNA, enligt tillverkarens rekommendationer.
   5. Justera den slutliga volymen för RNA-resuspension i nukleasfritt vatten, med en volym på 50 μL som vanligtvis används.
      OBS: I slutet av centrifugeringssteget för vattenvillig och organisk fasseparation (efter tillsats av 200 μl kloroform i Tri-Reagens LS) kommer membranet från enheten att vara längst ner i röret och inte störa insamlingen av den övre vattenfasen. Alternativt kan andra enkla och snabba protokoll användas, till exempel med fenolbaserade reagenser och kiseldioxidmembran²⁸.
2. Detektion av RT-qPCR²⁶
   OBS: Detektion av potentiella virus-RNA som finns i extraherade prover kan göras med hjälp av olika molekylära tekniker, såsom omvänd transkription PCR, konventionell (slutpunkt) eller realtid PCR (qPCR). Flera metoder finns tillgängliga, såsom konventionella RT-PCR^27,29 eller RT-qPCR^26,30 inriktning på viral nukleoprotein eller polymeras gen. Ett exempel kommer att presenteras nedan baserat på en dubbel kombinerad pan-lyssavirus RT-qPCR inriktning en bevarad region bland viral polymeras. Denna RT-qPCR-teknik associerar två olika RT-qPCR: en baserad på TaqMan sondteknik (pan-RABV RT-qPCR) och den andra med hjälp av SyBR Green detektion (pan-lyssa RT-qPCR). Dessutom sker detektion av en exogen intern kontroll (eGFP RNA) direkt spetsad under extraktionsprocessen av en specifik TaqMan-sondbaserad RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Noggrann validering på plats av de molekylära tekniker som valts ut för detektion av virus-RNA är viktigt, särskilt för att kontrollera att grundfärger och sonder för realtids-RT-PCR, är anpassade för detektion av de stammar som cirkulerar i området av intresse⁴.
   1. Späd RNA-prov till 1:10 i nukleasfritt vatten. Testa varje RNA-prov i två exemplar med hjälp av en 96-brunns reaktionsplatta eller andra format. Använd positiva och negativa kontroller för varje analys och testa åtminstone i två exemplar.
   2. Förbered huvudblandningsreaktionslösningen för de tre olika RT-qPCR-analyserna enligt tabell 1och med de grundfärger/sonder som anges i tabell 2.
   3. Tillsätt 5 μl utspädda RNA-prover och 15 μl master mix till var och en av de tre olika analyserna. Pan-RABV RT-qPCR-analysen och eGFP RT-qPCR-analysen kan cykla i samma platta.
   4. Kör de olika analyserna enligt de termiska cykelförhållanden som anges i tabell 3. Om endast en PCR termisk cykelcyktur kan du börja med pan-RABV RT-qPCR och håll plattan för pan-lyssa RT-qPCR vid 4 °C tills pan-RABV RT-qPCR är.
   5. Analysera de resultat som erhålls med de tre analyserna enligt tabell 4.

4. Genotypning efter RNA-extraktion från RIDT-enheten

1. Omvänd transkription RT^27,29
   1. Förbered en mastermix med 6 μL RNA, 2 μL pd(N)6 slumpmässiga grundfärger (200 μg/μL) och 2 μl nukleasfritt vatten för en slutlig volym på 10 μL.
   2. Inkubera vid 65 °C i 10 min i ett värmeblock och förvara sedan på is.
   3. Förbered en master mix med 6 μL 5x First-Strand Buffert, 2 μL av 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) av Upphöjd II omvänd transkriptas, 2 μL (80 U) RNasin, 2 μL dNTP-blandning (10 μM) och komplett med nukleasfritt vatten för att erhålla en slutlig volym på 20 μL för varje prov.
   4. Tillsätt huvudblandningen (20 μL) i provet (10 μL) (slutlig volym på 30 μL) och inkubera vid 42 °C i 90 minuter i ett värmeblock.
   5. Fortsätt till nästa steg med PCR förstärkning eller förvara cDNA vid -20 °C.
2. Konventionell PCR^27,29,31
   OBS: Olika tekniker för konventionell PCR finns tillgängliga för genotypning. Två presenteras, både hemi-kapslade PCR, inriktning en del av nucleoprotein eller en del av det virala proteinet i lyssavirus. Protokollet är detsamma för var och en av dessa analyser, med undantag för grundfärger och cykelförhållanden. Positiva (positiva RNA) och negativa kontroller (negativt cDNA och/eller nukleasfritt vatten) bör ingå i varje serie och varje pcr-omgång.
   1. Förbered för varje prov i en 0,2 ml mikroört en master mix reaktionslösning för det första PCR-steget. Denna blandning innehåller 5 μL 10x NH4 Reaction Buffer, 2,5 μL MgCl_2-lösning (50 mM), 1 μL dNTP-blandning (10 μM), 1 μl av varje primer (10 μM), 0,2 μl (1 U) biotaq-DNA-polymeras och 37,3 μl nukleasfritt vatten (slutlig volym på 48 μL). Grundfärgerna anges i tabell 5.
   2. Tillsätt 2 μl cDNA i varje rör och cykel på en separat konventionell PCR termisk cycler för varje analys, enligt tabell 6.
   3. Förbered en andra master mix reaktionslösning identisk med den föregående med användning av lämpliga grundfärger (tabell 5) för hemi-kapslade PCR reaktion.
   4. Tillsätt 2 μl av den första runda PCR-produkten och cykla på en konventionell PCR-termisk cykelcykel med hjälp av de cykelparametrar som anges i tabell 6.
   5. Visualisera de olika PCR-produkterna (första och andra rundan PCR) efter att ha laddat dem på en 1% agarosgel (100 ml Tris-acetat EDTA-buffert 1x - TAE 1x) med ethidiumbromid (slutlig koncentration runt 0,01%) och kör gelen under 30 min vid 120 V. Ett positivt PCR-resultat observeras i form av ett ljust band av den förväntade storleken (tabell 5).
3. Sanger sekvensering
   1. Utför en Sanger sekvensering av de amplicons som erhållits med pan-lyssavirus hemi-kapslade PCR och slutföra genotypning analys.

Discussion

RIDT är en enkel, snabb och billig metod för obduktionsdiagnos och ett lovande fältalternativ till laboratorietester. Tillämpningen av ett sådant test, särskilt för decentraliserade områden i låg- och medelinkomstländer, skulle förbättra förståelsen av prevalens och överföring av rabiesvirus på lokal och potentiellt nationell nivå. I kombination med den snabba hjärnan provinsamling metod (utan full obduktion), en stor fördel är att testet kan utföras helt i fältinställningen, bort från laboratorieanläggningar. Hjärnprover som samlats in via foramenmagnum kan användas för testning, därför är det inte nödvändigt att helt öppna djurskalle. Testet är enkelt att utföra och tolka och är särskilt lämpligt för fältövervakning¹⁴. Andra fördelar med RIDT jämfört med DFAT eller DRIT är inget behov av positiva och negativa kontroller och kit förvaring vid rumstemperatur. Dessutom kräver det ändrade protokollet, där utspädningssteget (1:10) i PBS utelämnas, inte extra reagenser för att utföra testet och förenklar förfarandet ytterligare under fältförhållanden.

En viktig punkt är kvaliteten på hjärnproverna. Proverna bör samlas in och testas så snart som möjligt efter det misstänkta djurets död, eller förvaras vid sval temperatur före testning, för att undvika nedbrytning. Sönderdelade prover bör inte testas eftersom det kan påverka resultatet (risk för falskt negativt resultat). Även om inga data finns ännu tillgängliga om förlust av känslighet ridt över tiden för hjärnprover, vi hypotesen att det liknar DFAT test³². Men tiden mellan djurets död och utföra testet kan minskas, eftersom testet kan göras snabbt och direkt i fältet. Det finns därför i allmänhet en lägre risk för förmultnade prover.

Ett annat viktigt steg i protokollet är provavstängningsmigrering. Migrationen bör påbörjas direkt efter deponering av provet (1-5 min). Kickviskosity av upphängningen kunde därför negativt påverka flyttningen. Försiktigt skrapa botten av enheten insättning webbplats med dropper och lägga till 1-2 fler droppar löser ofta detta problem, och migrationen börjar omedelbart efter.

De flesta av de RIDT-tester som utfördes i afrikanska laboratorier (Tchad, Elfenbenskusten och Mali) utfördes vid rumstemperatur som kan överstiga 30 °C, medan det temperaturintervall för lagring och användning som rekommenderas av tillverkaren är 15 °C - 30 °C. Även om vi inte identifiera någon inverkan av hög temperatur på RIDT testprestanda, är det nödvändigt att utvärdera det mer noggrant. På samma sätt behöver effekten av hög temperatur under lagring och transport av enheten efter användning för viral RNA-detektering och genotypning ytterligare utvärdering. Känsligheten hos den virala RNA-detekteringen av RT-qPCR från RIDT-remsan kan påverkas av kvaliteten på det hjärnprov som ursprungligen användes i testet, men också av tillståndet för lagring av RIDT-testerna efter användning. Till exempel var känsligheten hos RNA-detektering högre när använda RIDT-tester förvarades under kontrollerade laboratorieförhållanden (94,7 %) jämfört med under fältförhållanden (t.ex.¹⁴ Dessa förhållanden kan också påverka integriteten (särskilt längden) på RNA som är fast på remsan, vilket eventuellt förklarar den måttliga känsligheten för genotypning baserat på längre PCR-amplicons (t.ex. >500 nukleotider)¹⁴. Känsligheten för RT-qPCR som utfördes på testremsan var lägre än den som erhölls med FTA Whatman-kort (80,6 %)¹⁴. I likhet med andra molekylära tekniker kan virusbelastningen också påverka framgången med genotypning baserat på RDIT-remsor, med potentiella negativa resultat för prover med låg virusbelastning¹⁴.

Testet rekommenderas för närvarande inte av WHO och OIE för rutinmässig diagnos och sjukdomsövervakning, och ett resultat kan inte användas på egen hand för att styra PEP beslutsfattande. Ytterligare testvalidering behövs fortfarande. Exakt diagnos av snabb rabies är dock en viktig del av välfungerande kontinuerliga rabiesövervakningssystem och är avgörande för att öka det politiska engagemanget, vilket är oerhört viktigt för en framgångsrik hållbar rabieskontroll³³. RIDT-tester erbjuder nya rabies diagnostiska möjligheter i detta sammanhang och är ett användbart verktyg för att utöka djur rabies övervakning på fältet i låg- eller medelinkomsttagare enzootiska områden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed)	Bio-Rad, France	3572112	Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, France	4351104	Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper	-	-	Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, France	3574911	Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit	BioNote Inc., Republic of Korea	RG18-01DD	Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega, USA	N2515	Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, France	11732-020	Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
TRIzol Reagent	Invitrogen, France	15596026	Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT.