Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um neuartige Membrantransporter funktionell zu charakterisieren. Polyamine sind in allen Organismen allgegenwärtig, aber Polyaminaustauscher in Pflanzen wurden nicht identifiziert. Hier skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung von Polyamin-Antiportern mit Membranvesiken, die aus der Lyse von Escherichia coli-Zellen erzeugt werden, die heterolog einen Pflanzenantiporter exemitzen. Zunächst haben wir AtBAT1 heterolog in einem E. coli-Stamm mangelhaft in Polyamin- und Argininaustauschtransportern exprimiert. Vesikel wurden mit einer französischen Presse hergestellt, die durch Ultrazentrifugation gereinigt und in einem Membranfiltrationstest von markierten Substraten verwendet wird, um die Substratspezifität des Transporters zu demonstrieren. Diese Assays zeigten, dass AtBAT1 ein Proton-vermittelter Transporter von Arginin, Aminobuttersäure (GABA), Putrescin und Spermidin ist. Der mutierte Stamm, der für den Test von AtBAT1 entwickelt wurde, kann für die funktionelle Analyse anderer Familien von Pflanzen- und Tierpolyaminaustauschern nützlich sein. Wir gehen auch davon aus, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um viele andere Arten von Antiportern zu charakterisieren, solange diese Proteine in der bakteriellen Zellmembran exprimiert werden können. E. coli ist ein gutes System für die Charakterisierung neuartiger Transporter, da es mehrere Methoden gibt, die eingesetzt werden können, um einheimische Transporter zu mutagenisieren.