Este projeto foi possível graças ao financiamento fornecido pelo Children's Discovery Institute da Universidade de Washington e pelo St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Fundação do Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e pelo NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. é apoiado pelo NIH K08 HL123519 e burroughs Welcome Fund (1014782).

O protocolo apresentado foi aprovado pela Washington University em St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos os sujeitos fornecem consentimento informado antes da coleta de amostras e os experimentos são realizados de acordo com o protocolo de estudo aprovado. O protocolo apresentado é realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee da Washington University School of Medicine e segue as diretrizes descritas no Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório.
<p cla...

<ol>
	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

O protocolo permite a extração de vários subconjuntos de macrófagos do miocátrio humano. O protocolo é simples e leva de 3 a 4 horas para preparar a suspensão de célula única pronta para a análise facs. Embora o protocolo seja relativamente simples de executar, há certos aspectos técnicos que precisam ser considerados que minimizarão a variabilidade. Em primeiro lugar, trabalhar em tempo hábil com o tecido humano é necessário para a viabilidade celular ideal. É importante manter o tecido em saline frio /...

Os macrófagos representam o tipo de célula imune mais abundante no coração, e desempenham papéis significativos na geração de respostas inflamatórias e reparadoras robustas após lesão cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nosso grupo identificou dois grandes subconjuntos de macrófagos no coração de urina derivados de origens distintas do desenvolvimento5,6. Em termos gerais, populações distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes em tecidos podem ser identificadas com base na expressão da superfície celular do CCR2 (receptor de quimiocina 2 do motivo C-C). CCR2- macrófagos (expressão da superfície celular: CCR2-MHCIIbaixa e CCR2-MHCIIalta)são de origem embrionária (linhagens primitivas e erittroóides), capazes de auto-renovar, e representam uma população dominante em condições homeostáticas. Os CCR2+ macrófagos residentes são de origem hematopoiética definitiva, são mantidos através do recrutamento de monócitos circulantes e representam uma população menor em condições homeostáticas. Funcionalmente, CCR2- macrófagos geram inflamação mínima e são fundamentais para o desenvolvimento coronariano regeneração cardíaca neonatal5,7. Em contraste, CCR2+ macrófagos iniciam respostas inflamatórias robustas após insultos cardíacos e contribuem para a lesão por cardiomiócito colateral, remodelação adversa do ventrículo esquerdo e progressão da insuficiência cardíaca8,9.
Recentemente, mostramos que o miocásio humano também contém dois subconjuntos distintos de macrófagos identificados de forma semelhante como CCR2- ou CCR2+8. A expressão gênica e as análises funcionais revelaram que os CCR2 humanos- e os macrófagos CCR2+ representam subconjuntos funcionalmente divergentes e são funcionalmente análogos à CCR2- e CCR2+ macrófagos encontrados no coração do rato. CCR2 humano- macrófagos expressam níveis robustos de fatores de crescimento, incluindo IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. CCR2+ macrófagos são enriquecidos em quimiocinas e citocinas que promovem inflamação, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. Estimulados CCR2+ macrófagos secretam níveis marcadamente mais altos da citocina inflamatória interleucina-1β (IL-1β) na cultura. Como esses subconjuntos contribuem diferencialmente para a reparação de tecidos e a remodelação ventricular esquerda (LV) no contexto da lesão cardíaca continua a ser uma área de pesquisa ativa.
A análise baseada em citometria flow-ofuscar a heterogeneidade do macrófago no camundongo e no coração humano requer digerir o tecido cardíaco e gerar uma única suspensão celular seguida de análise citométrica de fluxo ou classificação celular para processos a jusante, como sequenciamento de RNA em massa/sequenciamento de RNA de célula única ou cultivo das células para ensaios funcionais. O protocolo original para fazer uma única suspensão celular de corações de urina foram relatados pela primeira vez pelo grupo Nahrendorf em Nahrendorf et al. 200710. Nosso laboratório adaptou e modificou o protocolo para extrair macrófagos do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com ligeira modificação no esquema de coloração e gating, CD45- células estromais do miocátrio humano também podem ser colhidas. Apresentado aqui, em texto e vídeo, é um protocolo que é realizado rotineiramente para a extração de macrófagos ou estromal do miocátrio humano.
Espécimes de tecido cardíaco são obtidos de pacientes adultos com cardiomiopatia dilatada (DCM: idiopática ou familiar) ou cardiomiopatia isquêmica (ICM) submetidos à implantação ou transplante cardíaco do dispositivo de assistência ventricular esquerda (LVAD). Os corações explantados ou os núcleos de LVAD são perfundidos intravascular com soro frio antes de começar o procedimento da digestão. É importante notar que a "qualidade" do espécime de tecido determinado em termos de grau de cicatrização ou infiltração de tecido adiposo pode afetar muito o rendimento dos macrófagos. Espécimes cardíacos com grandes áreas de cicatrizes terão rendimento celular muito menor e podem representar séria limitação técnica quando os métodos de análise a jusante desejados requerem cultivo de células in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

Macrófagos representam as populações de células imunes mais heterogêneas e abundantes no coração e são centrais na condução de inflamação e respostas reparadoras após lesão cardíaca. Como vários subconjuntos de macrófagos orquestram as respostas imunes após lesão cardíaca é uma área ativa de pesquisa. Apresentado aqui é um protocolo simples que nosso laboratório executa rotineiramente, para a extração de macrófagos de espécimes de miocánio humano e camundongos obtidos de indivíduos saudáveis e doentes. Resumidamente, este protocolo envolve digestão enzimática de tecido cardíaco para gerar uma única suspensão celular, seguido de coloração de anticorpos e citometria de fluxo. Esta técnica é adequada para ensaios funcionais realizados em células classificadas, bem como sequenciamento de RNA em massa e célula única. Uma grande vantagem deste protocolo é a sua simplicidade, variação mínima do dia a dia e ampla aplicabilidade que permite a investigação da heterogeneidade do macrófago em vários modelos de camundongos e entidades de doenças humanas.

O protocolo descrito permite o isolamento de macrófagos do mouse e do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com uma estratégia diferente de coloração e marcha, as células estromais também podem ser colhidas do miocánio humano. Os resultados da FACS aqui apresentados foram adquiridos na plataforma BD LSRII ou BD FACS ARIA III. Os controles de compensação foram gerados a partir de amostras de controle de cores únicas de splenocytes manchados. A Figur...

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Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.

Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

O coração contém população heterogênea de células imunes que desempenham papéis cruciais na inflamação cardíaca, bem como na reparação. Para entender a heterogeneidade das células imunes e obter mais informações sobre sua função, é importante ter um método que permita a recuperação dessas células do coração. Essa técnica pode ajudar a descobrir a diversidade de células imunes e não imunes que reside no coração saudável ou doente.Há três principais vantagens nessa técnica. Primeiro, é um simples fluxo de trabalho único que leva à geração de suspensão de célula única de vários tipos de células dentro de três horas de tempo. Em segundo lugar, leva à alta recuperação de populações de células imunes viáveis e não imunes.E terceiro, é um método muito versátil e pode ser aplicado a tecidos cardíacos em outras espécies também. Prestar atenção à quantidade de tecido usada para uma única reação de digestão é importante. Use tesoura estéril, disseque amostras de tecido da parede apical ou lateral do ventrículo esquerdo em soro fisiológico frio ou HBSS.Disseca cuidadosamente a gordura epicárardial e o chordae tendineae do espécime. Com a ajuda de uma lâmina ou tesoura estéril, disseque os pedaços de tecido em pedaços pesando aproximadamente 200 miligramas. Depois de eutanásia do rato, abra a cavidade torácica com a ajuda de uma tesoura afiada.Use hemostatas contundentes para levantar o coração para cima. Perfunda o coração com PBS frio usando uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de cinco mililitros. Perfuse até que o coração apareça branqueado em cores.Retire o coração e coloque-o em uma placa de Petri estéril no gelo. Coloque 200 miligramas de pedaços de tecido cardíaco humano ou coração murino em uma placa de Petri estéril. Pique bem o tecido usando uma lâmina ou uma tesoura estéreis.Para configurar digestões, em um tubo cônico de 15 mililitros, prepare um volume final de digestão de três mililitros para cada pedaço de tecido cardíaco humano ou um coração murino com enzimas colagenase I, DNase I e hialuronidase em concentrações de 450, 60 e 60 unidades por mililitro. Adicione 2,5 mililitros de DMEM no tubo. Com a ajuda de fórceps limpos, coloque o tecido finamente picado em cada tubo de reação.Misture bem com vórtice suave. Digerir por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de agitação definida a uma velocidade de agitação baixa a média. Após uma hora de digestão, retire os tubos da incubadora e coloque no gelo.Configure tubos cônicos de 50 mililitros com um coador de células de 40 mícrons em cima. Molhe os filtros com dois mililitros de enzima desativando o tampão. Em seguida, desative as enzimas de digestão adicionando oito mililitros de enzimas desativando tampão a cada tubo de digestão.Em seguida, despeje os 13 mililitros resultantes da mistura total através do coador de células de 40 mícrons nos tubos cônicos de 50 mililitros. Transfira as amostras filtradas de volta em tubos cônicos frescos de 15 mililitros. Gire as amostras a 400 vezes g por seis minutos a quatro graus Celsius.Descarte o supernatante deixando 0,5 mililitros de mídia. Resuspenque a pelota celular por pipetação suave e adicione um mililitro de tampão de lise ACK. Gire suavemente o tubo e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos para realizar a lise dos glóbulos vermelhos.Após cinco minutos no buffer ACK, adicione nove mililitros de DMEM à amostra. Coloque a tampa de volta nos tubos e inverta suavemente os tubos para misturar. Filtre através de um coador de células de 40 mícrons e colete o filtrado em tubos cônicos de 15 mililitros.Centrifugar os tubos a 400 vezes g por seis minutos e descartar o supernatante. Adicione um mililitro de tampão FACS e resuspense a pelota. Em seguida, transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar novamente a 400 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 100 microliters de tampão FACS. Uma única suspensão celular está pronta para coloração de anticorpos.Adicione um painel típico de anticorpos humanos às amostras do coração em uma a 50 diluições. Use diferentes anticorpos para células estromicas e macrófagos cardíacos murinos. Incubar por 30 a 40 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Adicione um mililitro de tampão FACS, vórtice suavemente e centrífuga a 400 vezes g por cinco minutos. Repita este passo de lavagem uma segunda vez. Em seguida, resuspenja a amostra em 350 microliters de tampão FACS e adicione DAPI para alcançar uma concentração final de um micromolar.As amostras estão prontas para análise facs. Neste protocolo, foi alcançado o isolamento dos macrófagos do rato e do miocárdio humano. Esta figura mostra núcleo LVAD humano não processado e processado.Foram apresentados o esquema de gating para a triagem de fluxo de macrófagos humanos negativos ccr2 e CCR2 do miocárdio humano, bem como para células estrômicas negativas CD45 da cardiomiopatia isquêmica humana. As imagens de Wright manchado FACS classificados CD45 positivo e CÉLULAS CD45 negativas mostram membrana celular intacta indicando viabilidade. O esquema de gating para classificar macrófagos de um coração de rato também foi bem sucedido.O peso do tecido usado para reação enzimática é fundamental para uma digestão eficiente. Use não mais do que 200 miligramas de tecido para as concentrações enzimáticas indicadas no protocolo. Seguindo este método, as células podem ser cultivadas para ensaios de estimulação in vitro.As células podem ser classificadas para sequenciamento de RNA em massa ou sequenciamento de células únicas. Este método tem servido como uma técnica inestimável na descoberta da heterogeneidade macrófago não reconhecida anteriormente não reconhecida que está presente no coração humano saudável ou doente. Usando este método seguido de sequenciamento de células únicas, estudos estão em andamento para descobrir como várias células imunes e não imunes variam de coração doente versus coração saudável.

Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos

Abstract