המחברים מודים לפרופסור רונג ג'ו על קריאה קריטית של כתב היד, וכל חברי המעבדה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (NSFC: 31571077; בייג, סין), פרויקט החדשנות של מדעי העיר גואנגזו וטכנולוגיות (201707020009; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין), "100 אנשים תוכנית" מאוניברסיטת סון יאט-סן (8300-18821104; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין), ומימון מחקר מתוך המעבדה מפתח המדינה של רפואת עיניים במרכז דז'ונגשאן אופטלמולוגי (303060202400339; גואנגג'ואו, פרובינציית גואנג-דונג, סין).

כל ההליכים הכרוכים בשימוש בעכברים אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש במרכז הבריאות של דז'ונגשאן, ודבקה בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר אופטלמולוגי וחזון.
1. חיתוך עין עם משטח עינית ועפעפיים שלמים
<ol><li>. לנתח את הראש<ol>
<li>המתת חסד יום לידה 10 (P10) ו P28 עכברים (לראות את ...

<ol>
	<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li><li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film.">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene.">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface.">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li><li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice.">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+of+the+conjunctiva:+A+review+of+recent+findings.">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li><li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction.">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li><li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo.">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta/activin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure.">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li><li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation.">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li><li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+(PLTP).">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity.">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li><li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium.">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene.">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li></ol>

תזכורת קריטית אחת להכנת העין שלמה היא כי כל עצמות מסלולית יש להסיר לחלוטין, במיוחד juga ועצמות lacrimal, אשר קטנים ממוקם ליד החלק התחתון של שקע העין. כל עצמות שמאל-מעל עלול לסבך את היסטולוגיה שלאחר מכן. במקרה פיסת עצם זעיר לא הוסר לחלוטין מניתוח בטעות, ניתן לבחור מתוך לחסום פרפין הטבעה באמצעות זוג...

המשטח העינית מורכב גיליון רציף של האפיתל הקרקע כולל palpebral לחמית, בולבר לחמית ו קרנית1. מבנים רבים הבלוטות משויכים האפיתל המשטח העינית ויחד לייצר שכבה של הסרט דמעה הגנה על משטח קרנית מפני ייבוש והסביבה פלישות2. הפרעה של מערכת ההפעלה תוביל לדלקת, דלקת הלחמית או שניהם (keratoconjunctivitis הלחמית). שני הגורמים הגנטיים והגירויים הסביבתיים או האינטראקציות שלהם תורמים לשינויים פתולוגיים של מערכת ההפעלה3,4. בהתאם, מגוון של מודלים מהונדסים גנטית, פיזית או כימית המושרה שימשו לחקר תהליכי מחלות של מערכת ההפעלה האנושית.
המבנה והתפקוד של מערכת ההפעלה של העכבר דומה לזה של בני אדם במובנים רבים. מרכיבי הסרט הקרוע שמופרשים על ידי בלוטות העינית דומים גם לעכברים ולבני האדם. הרבה מחקרים נערכו באמצעות מודלים העכבר להסבר מנגנוני היכרויות של מחלות האדם מערכת ההפעלה5,6,7. בהזדמנויות רבות, חשוב לנתח את הגלובלי במקום שינויים מולקולאריים מקומיים של מערכת ההפעלה כדי להשיג מידע מקיף תחת אותו טיפול ניסיוני. לכן, הכנה לדוגמה עם יושר טוב נדרשת כדי להבטיח כל חלק של מערכת ההפעלה להיות מנותח בו.
העכבר מערכת ההפעלה מקורביו בחוזקה עם גלגל העין כי היה מוטבע שקע העין/מסלול (ספל גרמי עשוי מספר עצמות הגולגולת שונים) ומתחבר אליו דרך רקמות חיבור דק. קיימים אתגרים עצומים לניתוח משטח העינית כולו מבלי לפגוע בpalpebral או בולבר לחמית. אתגרים אלה יורדים מ: (אני) מערכת ההפעלה היא רכה ורזה ומודבקת לתוך פיזית להפריד העפעפיים עדיין מטלטלין ועין, ולכן פגיע עיוות ונזק; ו-(ii) המרחב המוגבל בין עצמות המסלול לבין העין מגבילים את פעולות החיתוך. האתגרים הם הרבה יותר גדול עבור העכבר המבוגר. בתוך העכבר העובריים, ההתקשות עצם מסלולית אינו שלם והרקמות המקיפות הם יחסית רופף8. הראש ניתן להסיר ומנוכר, ולאחר מכן באופן ישיר בקיבוע של פאראפורמלדהיד (בשיא) קיבעון והטבעה9. לעומת זאת, העצמות לפני הלידה והעכבר למבוגרים הופכים להתקשות באופן מלא עם רקמות מסביב עבה, מה שהופך את החדירה של fixatives פחות יעיל. יתר על כן, עצמות מסלולית/הגולגולת הם קשים ושבירים, שבור בקלות כאשר מנציב אותם תרכובות הטבעה רכה כגון פרפין. פיסות עצמות שבורות יהיה פה אחד לקרוע את הרקמות הסמוכות וכתוצאה מכך מורפולוגיה רקמות נחות.
מחקרים רבים שפורסמו לעתים קרובות הראו משטח עינית חלקי, אשר עשוי להספיק למטרות מחקר מסוימות שלהם10,11. בדיקה ברוטו של הספרות מצאו רק מחקרים מראים את כל פני השטח העינית שלם הפגינו ללא תיאור מפורט של פרוטוקולי הניתוח12,13. בפרוטוקול זה, אנו מפורטים שיטת הניתוח להשגת משטח בלתי נפרד לאחר לידה העין, שבו מסלולית עצמות הגולגולת היו מסודרת הוסר, השארת משטח העינית ללא שינוי יחד עם העין והעפעפיים, למזער את הנזקים הפיזיים. בדקנו בהמשך את מערכת ההפעלה היסטולוגיה וביצעו אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעי הרקמה שהוכנו על-ידי פרוטוקול זה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>FG701-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Suggested concentration 1:500 - 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Suggested concentration 1:500 - 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-K12 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124975</td>
			<td>Suggested concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-K14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Suggested concentration 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope.</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave ovens</td>
			<td>Galanz</td>
			<td>P70D20TL-D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td>C57/BL6 and Sv129 mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501978-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 4% solution in 1&#215; PBS and filter with 0.45&#956;m filter membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBW6818</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact eyeball to obtain integral ocular surface tissue for histological examination and immunohistochemistry

משטח עינית (OS) מורכב גיליון אפיתל עם שלושה חלקים מחוברים: palpebral לחמית, בולבר לחמית האפיתל הקרנית. הפרעה של מערכת ההפעלה תוביל לדלקת, דלקת הלחמית או שניהם (keratoconjunctivitis הלחמית). ב מודלים בעלי חיים ניסיוניים עם שינויים גנטיים מסוימים או פעולות מלאכותיות, זה שימושי כדי לבחון את כל חלקי מערכת האפיתל של OS להערכת השינויים הפתולוגית היחסיים של כל חלק במקביל. עם זאת, ניתוח של רקמות מערכת ההפעלה כמכלול ללא עיוות או נזק כבר מאתגרת, בעיקר בשל רכות והתיקמות של מערכת ההפעלה המוצמדת פיזית להפריד העפעפיים עדיין והעין. בנוסף, שקע העין העמוק שנוצר על ידי עצמות הגולגולת/מסלולית קשה מאוכלס לגמרי על ידי גלגל העין עוזב מקום מוגבל לניתוח הפעלה. כתוצאה מכך, הניתוח הישיר של גלגל העין עם רקמות מערכת ההפעלה המשויכת מהצד הפנים לעתים קרובות להוביל לנזקי רקמות, במיוחד palpebral ו בולבר לחמית. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטה להסיר את הגולגולת ואת עצמות מסלולית ברציפות מראש עכבר מנוכר, עוזב את העפעפיים, משטח העינית, עדשה הרשתית לגמרי בחתיכה אחת. השלמות של גיליון מערכת ההפעלה השתמר היטב, וניתן היה לבחון אותו על ידי היסטולוגיה או חיסוני בסעיף אחד.

עצמות הגולגולת הגדולות הנצפים מזוויות שונות היו מאוירים באיור 1א-E, עם צבעים המציין עצמות שונות. השתמשנו בחיה בת ארבעה שבועות להדגמה של תהליכי הניתוח. בעקבות צעדים לחיתוך 1.1.1-1.1.3 וקיבעון קצר (שלב 1.1.4), גלגל העין עם עצמות הפנים המשויכים מומחש <strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry at JoVE.com

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של גלגל העין של העכבר עם עפעף, משטח עינית, מקטעים קדמי ואחורי במצב לא תקין יחסית.

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

המעבדה שלנו מתמקדת בהתפתחות העין והמחלות. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרת הגולגולת ועצמות המסלול ברצף מראש עכבר נותק. השארת עפעפיים, משטח העין, עדשה, ואת הרשתית כולם יחד בחתיכה אחת. הפרוטוקול יועיל רופאי עיניים המעוניינים דידקטיקה פני השטח העין. אני דיאנל גואו, לספר את הטכניקה עם מאבק סביר כאשר מנסים למנוע את נזקי גלגל העין, תוך ניתוח עצמות הפנים. היתרון העיקרי של חומר ניתוח זה הוא כי השלמות של גיליון אפיתל פני העין נשמר היטב ואת החלקים השונים של פני השטח העין ניתן לבחון על ידי היסטולוגיה או immunostaining בחלק אחד בודד. הקפד לחתוך את כל העצמות הקטנות ופסולת של הרקמות הרכות. הסיבה, זה יגרום סימני צלקת על סעיף רקמות אחרת. לאחר המתת חיטוי העכבר, השתמש בזוג מספריים ישרים כדי לחתוך את הראש וחצה אותו לאורך קו האמצע הסגיטלי החל מעצם תוך-לידתית לעצם האף. מניחים כל חצי מהראש החוצה לתוך צלחת פטרי נקייה ולהשתמש במספריים חדים כדי לחתוך את הלסת והלשון. לשחרר את עצב הראייה על ידי חיתוך אותו מהמוח לפני מיקום chiasm אופטי. ולהסיר את כל רקמות המוח כולל נורת הריח, אשר מחובר לקיר הגולגולת. עכשיו לכל הרקמות הנותרות יהיו את כל עצמות הגולגולת והמסלול הקשורות לעין. לשטוף את החלקים הנותרים עם PBS כדי לנקות את כל פסולת דם ושיער. תקן מראש את הרקמות על ידי הצבתן בצינור של 50 מיליליטר המכיל 4% paraformaldehyde ומסובב אותן בטמפרטורת החדר. לאחר השלמת הקידומת, שטפו במהירות את הראש המנותח ב- PBS שלוש פעמים כדי לחסל עוד יותר את השערות השבורות ואת התיקונים. מניחים את הרקמה לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ וחותכים את הגולגולת לשלושה חלקים לאורך המטוסים המצוין דמות אחת של פרוטוקול הטקסט. גלגל העין והשקע מוסתרים בחלק האמצעי של הגולגולת תחת עצמות אתמואידיות, חזיתיות ומקסיליות. השתמש בשני זוגות של מטלות מספר ארבע רצופות כדי לקלף את עצם האתמואיד ולחשוף באופן מלא את העצמות הקדמיות והמקסינריות. לאחר מכן, גיאוגרפית לחלק את פני השטח של הגולגולת לארבעה אזורים. הכנס את קצה המדפים המעוקלים אופקית לכל אזור כדי להסיר את העצמות המקסילינריות והחזיתיות ברצף. לאחר מכן, העצמות הארגמן והמג'יגאל הבסיסיות ייחשפו. הסר את שתי העצמות ואת השרירים התת עוריים הקשורים ושומנים המקיפים את גלגל העין. חותכים את גלגל העין עם עפעפיים מחוברים ועור לתוך בלוק קטן, בצורת ריבוע כדי להפחית את נפח הרקמה להקל על התמצאות הרקמה בעת הטבעה. הנח את גלגל העין ואת הרקמות הקשורות בחזרה לתוך 4%paraformaldehyde ולהמשיך לתקן לילה ב 4

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

Abstract