אנו מודים לד ר ג'ינגרן פנג על שיתוף הקו הטרנסגניים של Tg (fabp10a: DsRed) ; ד ר זילונג וון על שיתוף הקווים הטרנסגניים של Tg (mpeg1: GFP) ; ד ר קואיצ'י קווקאמי על אספקת וקטור pTol2. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771594), גואנג-דונג מדעי וטכנולוגיה תוכנית פרויקטים (2019A030317001) ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות (D2191450).

הערה: כל הדגימות טופלו על ידי פנילטימאוראה (PTU) מי ביצים כדי לעכב פיגמנט.
1. יצירת מבנים Tg (fabp10a: il34) והזרקת דגים
<ol><li>לשכפל את 2.8 kb fabp10a יזם8 ו-IL-34 באזורי הקידוד (ensdart 00000126460.3) של דג דג זברה לתוך וקטור pTol2 כדי ליצור את fabp10a il34 בניית. הכנס את המבנה ל?...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין על ההתנהגות של macrophagein vivo וההליך דורש מומחיות טכנית מסוימת. לסיכום, ישנם מספר שלבים קריטיים כדי למנוע סיבוכים בפרוטוקול: 1) לבחור קו טרנסגניים מתאים אשר מציג אות הטרנסגניים ספציפיים וחזקים כדי לתייג את תא הריבית; 2) לבחור את הרקמה ה?...

Zebrafish הוא קטן טרופי קשה עצמות מתוקים דגים מקורו בהודו. בנוגע לשימור הגנים, יש דמיון של 87% לאדם1. זה יכול לספק לנו תובנות על נושאים קשורים של בני אדם על ידי לימוד רגולציה גנים, חלבון תפקוד והתנהגות התא כגון הגירה, הפצת et.al ב zebrafish. העובר מדגים ניתן להשתמש כדי להתבונן התפתחות של עוברים מוקדם בשלבים שונים לאחר פיגמנט מעכב. בינתיים, זה לוקח רק שלושה חודשים כדי להתפתח בגרות מינית, אז דג הדגים יכול לייצר מאות ביצים כל 4 ימים. מיני גודל, רבייה פשוטה, קיבולת הרבייה חזקה, יתרונות אלה להפוך תרבות דג זברה מאוד חיסכון בחלל, תורם לתרבות בקנה מידה גדול. העכבר מודל היונקים המסורתי יש עלויות תחזוקה גבוהה יותר מאשר zebrafish, ולכן הגבלת היקף העלאת העכבר. בהיבט של התפתחות העובר המוקדם, העובר העכבר קשה להתבונן במצב חי בשל מאפייני התפתחות העובר העכבר ברחם האם. להיפך, עוברי דג מפתחים מבחוץ ושקופים, לכן קל להתבונן מתחת למיקרוסקופ. יתר על כן, דג זברה הוא קל מאוד לבנות מגוון של קווים טרנסגניים למחקר הקשורים לפונקציות גן. כיום, קווים טרנסגניים שונים הניתנים להוספת תוויות לסוגים שונים של תאים. זה מאוד נוח עכשיו לבנות קווים טרנסגניים כדי overexpress נוגדנים במיקומים ספציפיים וללמוד את הפונקציה נוגדנים על התנהגות התא ב-zebrafish.
כאן, סיפקנו זרימת עבודה כדי להשתמש בשורה הטרנסגניים של הדגים כדי לחקור את הפונקציה של IL-34 על התנהגות מקרופאג ב vivo2,3,4,5,6,7. ראשית, אנו בנינו ביטוי מופרז של הכבד היתר פלבאמצע של הגן il34 והזריק את הפלבאמצע לשלב של תא אחד Tg (MPEG1: gfp) עוברי דגים אשר במפורש מתויג מקרופאגים על ידי חלבון פלורסנט gfp. אז, השתמשנו פלורסנט כל הר באתרו היברידיזציה החיסונית כדי לזהות את התבנית של הביטוי il34 ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בשלבים אלה, הקמנו ובנו אימות של קו הייצור cytokine ויזואלית העריכו את ההשפעות שניתן לראות על התפלגות מקרופאג. לבסוף, כדי לחקור התנהגות מקרופאג בתגובה cytokine, השתמשנו הדמיה חיה קונפוקלית וקד להתבונן ישירות מקרופאג הגירה כדי לאשר את הפונקציה של il34 על הגירה מקרופאג בvivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

זברפיש משמשים רבות במחקר בסיסי וביורפואי. קווים הטרנסגניים רבים הזמינים כעת כדי לתייג סוגים שונים של תאים. בשל הגוף עובריים שקוף של דג zebrafish, זה נוח לנו ללמוד את ההשפעה של כימוקין אחד על ההתנהגות של סוג מסוים של תאים בvivo. כאן סיפקנו זרימת עבודה כדי לחקור את הפונקציה של כימוקין על הגירה מקרופאג ב vivo. בנינו ביטוי מופרז רקמות מוגזם כדי overexpression IL-34 והזריק את הפלבאמצע לתוך השלב תא אחד העוברים דגים מקרופאגים שסומנו במפורש על ידי חלבון פלורסנט. לאחר מכן השתמשנו פלואורסצנט הר שלם ב היברידיזציה באתרו ו חיסוני כדי לזהות את התבנית של הביטוי כימוקין ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בסופו של דבר, השתמשנו קונפוקלית וקד חי הדמיה כדי להתבונן ישירות התנהגות מקרופאג בדגים טרנסגניים יציבה כדי ללמוד את הפונקציה של IL-34 על מקרופאגים ב vivo.

השלבים המעורבים בפרוטוקול הדגים מאוירים באיור 2. ראשית, יצרנו את pBLK-fabp10a-il34-sv40 המבנה שבו il34 היה מונע על ידי היזם fabp10a (איור 2). המבנה היה microinjected לתוך תא אחד בשלב Tg (mpeg1: gfp) דג זברה עוברים אשר יכול לתייג מקרופאגים עם עוברי gfp ו W...

Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין ואת ההתנהגות של מקרופאג ' ב vivo. רוב המודלים הניסיוניים הקיימים של chemotaxis התא מבוססים על ניסויים בתאי במבחנה. אבל ניסויים במבחנה לפעמים הם פשוטים מדי כדי מודל הסביבה המורכבת ב vivo.כמו כן, הם לא יכולים לייצג את יכולת הכימותרפיה ב vivo. שיטות אלה מנצלות את היתרון הספציפי של דגי זברה לתצפית ישירה על התנהגות התא, דבר שקשה לעכברים. התחל על ידי יצירת TGFABP-10A אינטרלוקין-34 מבנים מהופנטים.להזריק את FABP-10A interleukin-34 מבנים לתוך תא אחד שלב Tg(mpeg1:GFP)מהופנט עוברי דגים מסוג בר יחד עם MRNA טרנספוסאז. להעלות ולאסוף את העוברים על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, לתקן אותם עם 4% paraformaldehyde לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לייבש את העוברים בנפרד עם 50% מתנול ב PBST, ואחריו 100% מתנול, ואז לשנות טרי 100% מתנול, ולאחסן אותם שלילי 20 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. כאשר מוכן להכלאה בדיקה, rehydrate העוברים בנפרד ב 50% מתנול ב PBST.לאחר מכן, לשטוף אותם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לעכל את העוברים עם proteinase K ב PBST בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השלך את פתרון העיכול, וחזור על קיבעון עם 4%paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים פעמיים עם PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף. בצע prehybridization עם חיץ הכלאה מחומם ב 65 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. לאחר מכן, מחממים את הבדיקה אינטרלוקין-34 ל 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.למחזר את חיץ ההכלאה לתוך הצינור המקורי ולבצע הכלאה עם בדיקה שחומם מראש ב 65 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים עם 50% formamide ו 2X SSCT ואחריו 2X SSCT ולאחר מכן 0.2X SSCT ב 65 מעלות צלזיוס. חוזרים על כל שטיפה שלוש פעמים עם 20 דקות לכביסה.לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. חסום את הדגימות עם 600 מיליליטר של חיץ חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון נוגדנים נגד digoxigenin HRP ולהדגיר את העוברים בארבע מעלות צלזיוס לילה.למחרת, להסיר את הנוגדן ולשטוף את העוברים שש פעמים עם PBST במשך 20 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף כל מדגם עם 30 microliters של 1X בתוספת דילואנט הגברה במשך חמש דקות. הדגירה את הדגימות בפתרון טיראמין פלואורופור במשך חמש עד 15 דקות בחושך.הארכת זמן הדגירה ל-30 דקות אם האותות חלשים. לאחר מכן, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות לכל לשטוף. ותדיגר אותם עם הנוגדן העיקרי ב-4 מעלות צלזיוס בן לילה.ביום שלמחר, לשטוף את העוברים חמש פעמים עם PBST במשך 30 דקות לכל לשטוף, ולהדקר אותם עם הנוגדנים המשניים בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף, ולאחסן אותם 70% גליצרול בחושך בארבע מעלות צלזיוס או שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך זמן רב יותר. לפני ההדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחור את העוברים החיוביים האדומים וה-GFP של DS.כדי להרים את הדגים, השתמש באמבט מתכת כדי לחמם מיליליטר אחד של 1% התכה נמוכה התעוררה מעל 90 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לקרר אותו לטמפרטורת הגוף ומערבבים 50 microliters של 0.2% tricaine. מעבירים את העוברים הרדמה לצלחת קטנה המותקנת עם מגלשת כיסוי בתחתית.מוציאים את המים שמסביב ומפילים באיטיות את ההמסה הנמוכה שעל העוברים. בזהירות להגדיר את המיקום של הדג לפני agarose התגבש, שמירה על אזור הכבד קרוב למגלשת הכיסוי. לאחר שהתעוררות התגבשה, בזהירות לכסות אותו עם שכבה אחרת של התעוררות כדי לחזק אותו.מניחים את המנה על שולחן נושאת המיקרוסקופ הקונפוקל, מכסים את הדגים בתתווית E2 בטרקאין ומתחילים בהדמיה. כדי להפעיל את מיקרוסקופ הקונפוקל, פתח את תוכנת Zen Black 2.3 ולחץ על אתר, לאחר מכן הדגירה, ולאחר מכן הגדר את הטמפרטורה ל -29 מעלות צלזיוס. לחץ על תפריט הרכישה ובחר את מצב הסריקה הנדרש ואת הלייזרים בתפריט ההתקנה החכמה.לאחר מכן בחר מחסנית Z ומיקום. לחץ על תפריט מעצב ניסיוני ובחר לאפשר ניסוי בלוק רב בבלוק הראשון כדי למצוא את המדגם תחת הגדלה נמוכה. לאחר מכן, עבור להגדלה הגבוהה ותן לאזור שנצפה במרכז שדה הראייה.הגדר את המיקום ואת מידע מחסנית Z. לאחר מכן, בחרו בעוצמת הלייזר המתאימה, בשכבות הסריקה ומהירות ההדמיה. לאחר הגדרת כל הבלוקים, הגדר את המספר המתאים של לולאות והתחל להקליט.פרוטוקול זה שימש להזרקת interleukin-34 ספציפי לכבד מעל ביטוי פלסמיד לעוברים דגים מהופנטים, אשר מקרופאגים תויגו עם GFP. פלואורסצנטיות מלאה של הר בהכלאה ו immunostaining situ שימשו כדי לנתח את הביטוי של אינטרלוקין-34 ואת מקרופאגים שכותרתו GFP. מספרי תאי המקרופאג' נותחו כמותית באזור העוברים והזנב הלא מנוגנים והוזרקו.הדמיה חיה שימשה להתבוננות ישירה מקרופאגים, שכותרתו ירוק, עובר על ידי הכבד של דג שליטה נודד לתוך הכבד של interleukin-34 מעל ביטוי דגים. השלבים החשובים של פרוטוקול זה כוללים את הבחירה של קו מהומר מתאים כדי לתייג את התא של עניין. ורקמות מתאימות להדמיה הביטוי שלך של גן מהומר, כמו גם חלון זמן תצפית מתאים.טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הפונקציה של כימוקינים אחרים על ההתנהגות של תאים אחרים, כגון תאי T ונויטרופילים ב vivo.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

Abstract