이 작품은 NIH 보조금 P50 CA174521에 의해 지원되었다 (J.R. 하우와 A.M. 벨리치에). P.H. Ear는 P50 CA174521 커리어 향상 프로그램 상을 수상했습니다.

인간 신경 내분비 종양 견본을 사용하여 모든 실험은 아이오와 대학 병원 및 진료소 IRB 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 199911057). 모든 재료 및 장비 의 목록은 재료 표에설명되어 있습니다. 성장 미디어 및 주요 솔루션 목록은 표 1에서찾을 수 있습니다.
1. 작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNET) 수집 및 세포 해리
<ol><li>외과 병리학 코어에...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

종양 3D 배양은 전임상 약물 시험15에대한 귀중한 자원이 되었다. 다양한 종양 오르가노이드 바이오뱅크는 최근 유방암 및 전립선암 종양16,17에서설립되었다. 본 연구에서, 우리는 SBNET배양에 대한 상세한 프로토콜을 스페로이드로 하고 면역형광 및 시험 약물 감도에 의해 NET 마커에 대한 스페로이드 배양을 검증하는 간단하고 빠른 방?...

작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNETs)는 소장의 엔테로크로마틴 세포에서 유래합니다. SBNETs는 일반적으로 천천히 성장하는 것으로 알려져 있지만, 그들은 일반적으로 간1에전이. 외과 제거 또는 종양 절제는 많은 경우에 고려될 수 있는 동안, 재발은 거의 보편적이고, 그러므로, 의학 치료는 관리에 있는 중요한 역할을 합니다. 약물 검사를 위한 새로운 SBNET 세포주를 생성하기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다. 그러나, 거의 성공이 있었다. 만 6 SBNET 세포주 (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5보고되었습니다; 불행하게도 하나의 세포주들은 더 이상 NET 마커6및 3개의 다른 SBNET 세포주(KRJ-I, L-STS, H-STS)를 발현하지 않고 NETs7대신형 림프체로부터 유래되는 것으로 결정되었다. SBNET를 표적으로 하는 약물의 식별을 가속화하기 위해서는 시험관 내 약물 검사를 위한 대체 방법이 필요합니다.
여기에서, 우리는 절제된 SBNETs의 가용성을 이용하고 ECM에서 성장하는 스페로이드로 이 환자 파생 SBNETs를 배양하는 쪽을 설치했습니다. 이 원고의 전반적인 목표는 면역형광 염색 및 면역조직화학에 의한 SBNET 마커의 보존을 위해 이러한 스페로이드를 특성화하는 3차원(3D) 배양 및 개요 절차로서 SBNET 배양 방법을 설명하는 것이다.
또한, 우리는 이러한 SBNET 스페로이드가 NETS8의항암 약물인 라파마이신의 효과를 테스트하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이 프로토콜의 근거는 시험관에서 SBNET 세포를 성장하고 약물 검사에 사용하는 새로운 방법을 개발하는 것입니다. SBNET 세포주를 확립하는 전통적인 방법에 비해 이 기술의 장점은 SBNE의 3D 배양이 빠르게 얻을 수 있고 약물 검사가 3 주 이내에 수행 될 수 있다는 것입니다. SBNET 스페로이드는 잠재적으로 SBNET 환자를 위한 새로운 약을 확인하기 위하여 시험관 내 약 스크린을 능력을 발휘하기 위한 모형으로 이용될 수 있었습니다. SBNET 세포주들은 널리 사용할 수 없기 때문에, SBNET 스페로이드의 3D 배양은 SBNE를 연구하기 위한 새로운 시험관 내 모델로 사용될 수 있으며, 현장의 과학자들 사이에서 공유될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNETs)는 창자의 enterochromaffin 세포에서 유래하는 희소한 암입니다. 이 분야의 연구는 SBNET 세포주에서 유래된 환자가 거의 없기 때문에 제한적이었다. 잘 분화된 SBNET 셀은 천천히 성장하고 전파하기 어렵습니다. 확립된 몇몇 세포주는 쉽게 유효하지 않으며, 배양에 있는 시간 후에 NET 세포의 특성을 발현하는 것을 계속하지 않을 수 있습니다. SBNET 세포는 긴 두 배의 시간을 가지고 있기 때문에 새로운 세포주를 생성하는 것은 많은 년이 걸릴 수 있고 급속하게 분할하는 암 관련 섬유아세포를 제거하기 위하여 많은 농축 단계가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 스페로이드로 외과적으로 제거 된 종양으로부터 SBNET 세포를 배양하는 프로토콜을 개발했습니다. ECM은 SBNET 세포를 캡슐화하고 SBNET 세포가 성장할 수 있도록 종양 미세 환경을 모방하는 3차원 매트릭스를 형성합니다. 여기서, 우리는 SBNET 스페로이드의 성장 속도를 특징으로 하고, spheroids가 신경 내분비 종양 세포임을 확인하기 위해 면역형광 현미경 및 면역조직화학을 사용하여 SBNET 마커를 식별하는 방법을 기술하였다. 또한, 우리는 라파마이신의 세포 독성을 테스트하기 위해 SBNET 스페로이드를 사용했습니다.

현재 2개의 SBNET 세포주만 설립되고 출판되어2,3,4,5가 있으며 많은 연구자들이 쉽게 이용할 수 없습니다. 여기서, 우리는 ECM에서 스페로이드로 배양 SBNET을 제안하고 SBNET 약물 감도를 연구하는 대체 모델로 이것을 사용합니다. 간으로 전이된 SBNET으로부터 환자 유래 종양을 수집, 소화하여 SBNET 세포를 ?...

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Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

신경 내분비 종양 (NETs) 신경 문장의 신경 내분비 세포에서 유래. 그들은 천천히 성장하고 문화에 도전. 우리는 스페로이드로 그들을 배양하여 작은 창자에서 NET를 성장하는 대체 전략을 제시한다. 이 스페로이드는 작은 창자 그물 마커가 있고 약 시험을 위해 이용될 수 있습니다.

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

잘 분화 된 SBNET 세포는 천천히 성장하고 전파하기 어렵다. 몇몇 확립된 세포주는 연구원에 쉽게 유효하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이 3D 배양 프로토콜을 개발했습니다.SBNET 세포주를 확립하는 전통적인 방법에 비해 이 기술의 장점은 3D 배양을 얻을 수 있고 약물 검사를 3주 이내에 수행할 수 있다는 것이다. 이 방법은 췌장에서 신경 내분비 종양과 같은 다른 신경 내분비 종양에 적용 될 수있다. 절제된 환자 SBNET 샘플을 얻은 후 5밀리미터 큐브로 잘라 서 운송을 위한 원문 튜브에 DMEM F12 배지의 25 밀리리터에 저장합니다.15 분 동안 원고 지시에 따라 준비 된 세척 매체에서 종양을 배양합니다. 그런 다음 새 접시에 옮기고 멸균 곡선 가위를 사용하여 1밀리미터 미만의 조각으로 다진다. 다진 조직을 세척 매체 25밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮긴 다음, 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 500배 g로 원심분리합니다.상체를 버리고 콜라게나아제와 DNase로 세척 매체의 10 밀리리터에 펠릿을 다시 분리합니다. 다진 종양이 섭씨 37도에서 90분 동안 느리게 흔들리는 것을 허용합니다. 종양 샘플을 과도하게 소화하지 않는 것이 중요합니다.너무 많은 효소 또는 더 긴 잠복기 는 SBNET 세포를 죽일 것입니다. 소화가 완료되면 튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 500배 g로 원심분리합니다. 상체를 버리고 15 밀리리터의 세척 매체로 펠릿을 다시 놓습니다.새로운 50 밀리리터 튜브 위에 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 배치하고 스트레이너를 통해 세척 버퍼의 10 밀리리터를 전송합니다. 튜브 내부의 세척 버퍼를 소용돌이쳐 세포가 측면에 달라붙지 않도록 합니다. 그런 다음 여과기를 통해 셀 서스펜션을 필터링합니다.섭씨 4도에서 15분 동안 500배 g의 원심분리. 상체를 버리고 200 마이크로리터의 세척 매체에 펠릿을 다시 놓습니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 혈종계로 셀 카운트에 셀의 5 마이크로리터를 사용합니다.세포의 수를 계산한 다음 원심분리를 반복하여 상신체를 제거하고 밀리리터당 백만 개의 세포농도로 액체 ECM의 세포를 재연한다. 다음으로, ECM에 있는 SBNET 스페로이드 5~20마이크로리터를 ECM에 96웰 플레이트로 옮기고, 액체 ECM이 고화될 수 있도록 섭씨 37도에 플레이트를 놓는다. 이전에 설명한 바와 같이 줄기 세포 배지에서 구균 또는 배양스포지드를 포함하는 각 우물에 SBNET 배양 배지의 200 마이크로리터를 첨가한다.P1000 파이펫을 사용하여 오르가노이드를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 1분 동안 1, 500배 g의 원심분리기로 튜브를 원심분리하여 상체를 제거합니다. PBS와 원심분리기 의 1 밀리리터로 문화를 씻어 주체를 제거합니다. 그런 다음 파라포름알데히드의 500 마이크로 리터를 추가하고 15 분 동안 배양하여 오르가노이드를 수정합니다.인큐베이션 후 PBS의 1 밀리리터로 문화를 두 번 씻으시다. 3%BSA와 0.1%트리톤 X-100으로 PBS 500 마이크로리터를 추가하여 문화를 침투합니다. 튜브를 5분 동안 배양한 다음 PBS 1밀리리터와 3%BSA로 오르가노이드를 세 번 세척합니다.다음으로, 1차 항체로 배양한 다음 PBS 및 BSA로 세차를 반복한다. 이차 항체로 배양하고 모든 수퍼나티를 흡인하고 폐기하는 것을 확인하는 세차재를 반복합니다. 스페로이드를 이미지화하려면 DAPI가 포함된 마운팅 매체 5마이크로리터를 추가하고 P20 파이펫을 사용하여 스페로이드 5마이크로리터를 유리 슬라이드로 전송합니다.10, 20 및 40X 목표를 사용하여 형광 현미경으로 슬라이드를 밀봉하십시오. 기계적으로 P1000 파이펫으로 ECM을 분해하고 멸균 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 4섭씨에서 1, 000배 g의 원심분리기.그런 다음 모든 상체를 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 펠릿에 새 ECM의 2~4배 의 부피를 추가하고 기포를 도입하지 않도록 10배 위아래로 파이프를 사용하여 튜브의 내용을 혼합합니다. ECM 및 SBNET 혼합물의 5~20마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 ECM이 고화될 수 있도록 한다.그런 다음 고화된 ECM을 새로운 SBNET 배지로 덮고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. SBNET 스페로이드를 다른 실험실로 배송하는 경우 새 ECM을 T25 플라스크로 전송하고 ECM이 응고할 수 있도록 합니다. 플라스크를 SBNET 스페로이드 매체로 채우고 캡을 단단히 고정하고 배송 패키지를 준비합니다.스페로이드 배양을 받으면 배양 배지를 제거하고 이전 단계를 반복하여 스페로이드를 다시 배양에 넣습니다. SBNET 스페로이드 성장 속도는 현미경 이미징으로 모니터링되었습니다. 문화 매체가 일주일에 한 번 변경될 때 SBNET 스페로이드의 크기가 두 배가 되는 데는 약 14일이 소요됩니다.문화에서 14 일 후, SBNET 스페로이드는 크기가 증가하지 않습니다. 스페로이드는 시냅토피신, 염색체 A 및 SSTR2에 대한 특정 항체로 염색되고 면역 형광 현미경 검사를 사용하여 이미지화되었다. 데이터는 이 마커가 세포질 및 SBNET 세포의 막에서 국소화된다는 것을 보여주었습니다.항체의 특이성을 보장하기 위해 시냅토피신, 염색체 A 및 SSTR2를 발현하지 않는 췌장 종양으로부터 유기성 선상에서 동일한 염색 절차가 수행되었으며 녹색 신호는 발견되지 않았다. 면역형광 영상의 주요 장점은 4시간 이내에 수행될 수 있고 면역조직화학과 유사한 염색 정보를 제공할 수 있다는 것이다. SBNET을 스페로이드로 배양하는 것은 SBNET 성장을 저해할 수 있는 약물을 식별하는 데 중요한 기술입니다.스페로이드는 라파마이신과 mTOR 억제제로 치료되었다. 5 일 후, 라파마이신 처리 스페로이드는 포도 같은 구조를 형성하고 apoptotic 또는 괴사가되었다. 이 절차를 시도할 때, 셀 스트레이너와 수집 튜브를 세척 매체로 미리 적재하는 것이 중요합니다.이렇게 하면 SBNET 세포가 세포 여과기와 플라스틱 튜브에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 과학자와 임상의는 절제된 종양에서 SBNET 스페로이드 배양을 확립하고 다른 실험실과 공유하고 FDA 승인 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

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