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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Abstract

Os mioblastos preliminares são precursores proliferating indiferenciados do músculo esqueletal. Eles podem ser cultivados e estudados como precursores musculares ou induzidos a se diferenciar em estágios posteriores do desenvolvimento muscular. O protocolo fornecido aqui descreve um método robusto para o isolamento e a cultura de uma população altamente proliferativa de células mioblastos de explantes de músculo esquelético do rato adulto jovem. Estas pilhas são úteis para o estudo das propriedades metabólicas do músculo esqueletal de modelos diferentes do rato, assim como em outras aplicações a jusante tais como o transfection com ADN exógeno ou a transdução com vetores da expressão viral. O nível de diferenciação e perfil metabólico dessas células depende do comprimento da exposição e da composição dos meios utilizados para induzir a diferenciação mioblástica. Estes métodos fornecem um sistema robusto para o estudo do metabolismo de células musculares do rato ex vivo. É importante ressaltar que, diferentemente dos modelos in vivo, os métodos aqui descritos fornecem uma população celular que pode ser expandida e estudada com altos níveis de reprodutibilidade.

Introduction

Embora muitas vezes citado como uma indicação de saúde metabólica global, vários estudos mostraram que o índice de massa corporal (IMC) em idosos não está consistentemente associado com maior risco de mortalidade. Até o momento, o único fator que se mostrou consistente com a redução da mortalidade nessa população é o aumento da massa muscular1. O tecido muscular representa uma das maiores fontes de células sensíveis à insulina no corpo e, portanto, é crítico na manutenção da homeostase metabólica geral2. A ativação do tecido do músculo esqueletal através do exercício é associada com os aumentos na sensibilidade de insuli....

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Scripps Research.

1. coleta e processamento de explantes do tecido muscular

  1. O dia anterior à dissecção, esterilizar todos os equipamentos de dissecção (fórceps, lâminas de barbear e tesoura) e preparar todos os meios necessários: fosfato tampão salina (PBS), MB chapeamento de mídia (12,5 mL de DMEM, 12,5 mL de PRESUNTOS F12, 20 mL de calor-inativado fetal bovino soro (FBS), 5 mL de suplemento médio líquido amni.......

Representative Results

Após a seção 1 do protocolo fornecido deve-se produzir células primárias emergindo dos explantes que serão visíveis um microscópio de luz padrão (Figura 2). Uma população heterogênea da pilha será vista crescer fora e em torno de cada explant do tecido do músculo. Os Myoblasts aparecerão como esferas pequenas, redondas, brilhantes. A seção 2 do protocolo produzirá colheitas precoces de mioblasts de explantes teciduais, que conterá poucas c?.......

Discussion

O músculo esquelético é vital para o estabelecimento e manutenção da homeostase metabólica11. O estudo da fisiologia muscular é complicado pela variabilidade interindividual, bem como dificuldade na obtenção de amostras, particularmente no caso de estudos humanos. Os miotubos preliminares cultivados foram mostrados para recapitular muitas características da fisiologia do músculo, incluindo a homeostase12do cálcio, regeneração do tecido danificado

Disclosures

Nenhum.

Acknowledgements

Os autores são gratos ao Dr. Matthew Watt na Universidade de Melbourne e Dr. Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins para assistência adotando este protocolo com base no trabalho de Mokbel et al.6. Agradecemos também ao Dr. Sabine Jordan a ajuda para desenvolver e adotar este protocolo em nosso laboratório. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde R01s DK097164 e DK112927 para K.A.L.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Coating Solution:
DMEMGibco10569010Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12Lonza12-615FAlways add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
CollagenLife TechnologiesA10644011.7 mL
MatrigelFisherCB40234A1 mL
Plating Media:
DMEMGibco10569010Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12Lonza12-615FAlways add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBSLife Technologies1600004420 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
AmniomaxLife Technologies125560235 mL
Myoblast Media:
DMEMGibco10569010Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12Lonza12-615FAlways add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBSLife Technologies1600004410 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
AmniomaxLife Technologies125560235 mL
Differentiation Media:
DMEMGibco10569010Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12Lonza12-615FAlways add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse SerumSigmaH11381.5 mL
Insulin-Selenium-TransferrinLife Technologies414000450.5 mL
Other Materials:
PBSGibco14040133
GentamicinSigmaG1397
TrypLEGibco12604013
DMSOSigma472301Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
ForcepsAny
Razor BladesAny
ScissorsAny
Whatman paperVWR21427-648
60 mm plateVWR734-2318
10 cm plateVWR25382-428 (CS)
T25 FlasksThermoFisher156367
T75 FlasksThermoFisher156499
Centrifuge Tubes (15mL)BioPioneerCNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentSeahorse XFe96 AnalyzerInstrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-10096-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrateAgilent102720-100components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acidSigmaP5585-10Gfor measurement of fatty acid oxidation
carnitineSigmaC0283-5Gfor measurement of fatty acid oxidation
EtomoxirSigmaE1905for measurement of fatty acid oxidation
BSASigmaA7030used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation

References

  1. Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
  2. Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T.

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