Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Resumo

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B).

Resumo

Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, poucos métodos são aplicáveis para detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento. Aqui, descrevemos uma abordagem de imagem para determinar o estado oligomérico médio de homocomplexos do receptor marcado pelo mEGFP na membrana das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B). A N&B é um método semelhante à espectroscopia fluorescência-correlação (FCS) e fótons contando histograma (PCH), que são baseados na análise estatística das flutuações da intensidade da fluorescência da fluorofia difundindo dentro e fora de uma iluminação volume durante um tempo de observação. Em particular, a N&B é uma simplificação da PCH para obter informações sobre o número médio de proteínas em misturas oligoméricas. As amplitudes da flutuação da intensidade são descritas pelo brilho molecular do fluorophore e pelo número médio de fluorophores dentro do volume da iluminação. Assim, a N&B considera apenas o primeiro e segundo momentos da distribuição de amplitude, ou seja, a intensidade média e a variação. Esta é, ao mesmo tempo, a força e a fraqueza do método. Como apenas dois momentos são considerados, a N&B não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima apenas o estado médio de oligomerização da mistura. No entanto, ele pode ser aplicado a séries de tempo relativamente pequenas (em comparação com outros métodos de momento) de imagens de células vivas em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações de tempo da intensidade da fluorescência. Ele reduz o tempo eficaz por pixel para alguns microssegundos, permitindo a aquisição no intervalo de tempo de segundos a milissegundos, o que é necessário para cinética de oligomerização rápida. Finalmente, grandes áreas celulares, bem como compartimentos subcelulares podem ser explorados.

Introdução

Descrevemos uma abordagem de imagem total de reflexão interna fluorescência-número e brilho (TIRF-N&B) para determinar o estado oligomérico médio das moléculas receptoras na membrana plasmática das células vivas, com o objetivo de vincular a montagem do receptor dinâmica para a função biológica das proteínas (Figura 1).

Após a ligação extracelular do ligand, os receptores iniciam a transdução de sinal intracelular dependendo de sua conformação, oligomerização, potenciais co-receptores e composição da membrana. Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, reconhecida como um evento-chave na sinalização celular^{1,2,3,4,5,6, 7,}poucos métodos podem detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento experimentalmente^8,9. O volume confocal (x, y - 300 nm, z 900 nm) é insuficientemente resolvido para provar a interação molecular e stoichiometria, mesmo após a otimização por algoritmos de restauração de imagem¹⁰. A composição sub-unitária de oligomeros proteicos não pode ser resolvida de forma puramente espacial, mesmo por métodos de super-resolução em x,y resolução de 20-70 nm, como PALM¹¹, STORM^12,e STED¹³. Além disso, sua resolução temporal (na ordem dos minutos por imagem) não pode seguir a cinética na faixa de segundos. Único molécula passo-branqueamento resolve a stoichiometria de oligomeros de proteína apenas se eles são imóvel¹⁴.

Um dos métodos mais versáteis para medir a densidade e o oligomerização de proteínas fluorescentes marcadas dentro de imagens individuais é a análise de distribuição de intensidade espacial (SpIDA), que depende da amostragem espacial. É aplicável a células quimicamente fixas e vivas, e permite a análise de várias regiões de interesse da célula simultaneamente usando microscopia fluorescência padrão¹⁵. Alternativamente, métodos momentâneos, como espectroscopia fluorescência-correlação (FCS)^16,fótons contando histograma (PCH)¹⁷, e Número e Brilho (N&B)^18,19, são adequados para oligomer quantitativo Medidas. Esses métodos analisam as flutuações de intensidade da fluorescência que podem ser observadas no tempo em que os fluorofforas se difundem dentro e fora de um volume de iluminação. As amplitudes das flutuações de intensidade podem ser descritas exclusivamente pelo brilho molecular do fluorofforre (ε) e pelo número médio de fluorofônicos (n) dentro do volume de iluminação¹⁷ (Figura 2). Normalmente, o coeficiente de difusão dos fluorofforos e o número médio de moléculas (inversamente relacionadas ao valor G(0) dentro do volume de iluminação podem ser obtidos pela FCS²⁰. No entanto, uma vez que o tempo de difusão apenas escalas com a raiz cúbica da massa, FCS não é suficientemente sensível para detectar alterações na massa molecular²¹. Na prática, a FCS de cor única não consegue detectar a dimerização dos receptores de membrana. PCH resolve misturas de diferentes oligomeros com precisão. Usando mais de dois momentos da distribuição da amplitude, detecta moléculas do brilho diferente que ocupam o mesmo volume da iluminação. Digitalização FCS²² e desenvolvimentos, como a interessante par-correlação de brilho molecular (pCOMB) abordagem²³, introduzido para estender a gama de aplicabilidade dos métodos de correlação fluorescência em sistemas biológicos²⁴ , permanecem métodos de ponto único sem a capacidade de medições rápidas em uma grande área de uma célula, exigindo muitas observações consecutivas em cada pixel e aquisição de dados na ordem de segundos.

A N&B é uma versão simplificada do PCH que considera apenas o primeiro e segundo momentos da amplitude da distribuição de fluorescência, ou seja, a intensidade média, e a variação, σ² (Figura 2)^18,19 e, por causa disso, não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima somente o estado médio do oligomerization da mistura. No entanto, a N&B tem a vantagem de trabalhar com uma série de imagens de imagens de células vivas relativamente menores do que a PCH em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações no tempo da intensidade da fluorescência. Como a N&B reduz o tempo por pixel para alguns microssegundos, ela pode seguir cinética de oligomerização rápida sobre grandes áreas celulares, permitindo a aquisição de imagem em uma escala de tempo de segundos em microscopia de varredura de raster (por exemplo, confocal, 2 fótons) e milissegundos em microscopia baseada em câmera (por exemplo, TIRFM).

Vários relatos demonstraram a capacidade da N&B de quantificar o número de subunidades em aglomerados de proteínas por meio de imagens de regiões celulares estendidas. Os clusters Paxillin-EGFP foram detectados nos locais de adesão nas células CHO-K1^25,e a agregação intracelular do peptídeo httex1p patogênico foi descrita nas células COS-7²⁶. A N&B foi aplicada para seguir a oligomerização ativa da ligand do receptor^{ErbB 27,}e o efeito do ligand FGF21 em Klothob (KLB) e fgfr1c em células^{HeLa 28}. A combinação de imagens tirf e análise de N&B foi usada para mostrar que a dinamina-2 é principalmente tetramérica em toda a membrana celular²⁹. Aplicamos a N&B a imagens de varredura de raster e TIRF para provar a dimerização conduzida por ligand dos receptores de membrana celular uPAR e FGFR1^30,31.

Métodos de correlação de fluorescência, como N&B, FCS e PCH, são baseados na noção de que, em um volume aberto, o número de bolhas de partículas segue uma distribuição de Poisson. Como somente os fótons que os fluorofônicos emitem podem ser detectados, o valor médio para uma intensidade de fluorescência medida versus o tempo em um pixel da imagem, é o produto do número médio de fluorofosforas no volume de iluminação, n, e sua brilho molecular, ε¹⁷:

onde o ε é expresso como o número de fótons emitidos por unidade de tempo (convencionalmente por segundo) por molécula quando a molécula está no centro do volume de iluminação.

O brilho é propriedade de cada fluorofofóbico em uma determinada aquisição criada, enquanto a intensidade é a soma de todas as contribuições de todos os fluorofos. Em competições biológicas, o brilho aumentará com o aumento do número de fluorofos que flutuam junto, dando a informação no estado do oligomerization da proteína fluorescente-etiquetada. As amplitudes de flutuação em um determinado pixel é medido a partir da variação do sinal de fluorescência, σ²:

Onde a média do quadrado de intensidade, e o quadrado da média de intensidade, são computados a partir dos valores de intensidade individual em cada pixel de cada quadro:

onde K é o número de quadros totais na série de tempo. Experimentalmente, é necessário calcular para toda a série de imagens a variação que descreve a dispersão dos valores de intensidade individual em cada pixel de uma única imagem em torno do valor de intensidade média. A variação inclui todas as flutuações de diferentes origens. Em uma primeira aproximação, a variação devido às partículas de difusão no volume de iluminação, σ²_0,pode ser separada da variância devido ao ruído do tiro do detector, σ²_d. As duas variações são independentes; assim, a variação total é dada por sua soma:

A variação, devido a flutuações moleculares dentro e fora do volume de detecção, é linearmente dependente do brilho e intensidade moleculares:

Reorganizando eq. 6 de acordo com o eq. 1:

De acordo com o conceito típico de espectroscopia de correlação de fluorescência, a equação 7 afirma que a variação devido ao número de flutuações depende do quadrado do brilho das partículas.

Em seguida, a variação devido às flutuações do detector é uma função linear da intensidade detectada, a suposição de que o detector é operado abaixo de seu limite de saturação¹⁹:

No caso dos detectores de contagem de fótons =1e c=0, assim a variação do detector é igual à intensidade média:

Para aplicar esses conceitos a medições reais em células vivas, Gratton e colegas¹⁸ definem o brilho aparente, B, para cada pixel como a proporção da variação sobre a intensidade média:

B é o parâmetro que é medido experimentalmente. Neste trabalho, imagens de séries de tempo de receptores FGFR1 na membrana plasmática das células HeLa são capturadas pela microscopia TIRF e o brilho aparente médio, B, é determinado pela análise de N&B. Então, após a adição de FGF2, séries de tempo consecutivos são capturadas para acompanhar as mudanças na auto-montagem das moléculas receptoras na superfície da membrana após a estimulação do receptor com o ligand canônico.

No entanto, uma vez que o detector do microscópio TIRF é uma câmera EMCCD, a expressão para o brilho aparente precisa ser modificada como¹⁹:

onde o deslocamento é o deslocamento da intensidade da eletrônica da deteção que é uma característica das ajustes do detetor. A variação e a intensidade média de um detector analógico são, respectivamente, dadas por:

onde G é o ganho analógico em níveis digitais (DL/fótons), S, os níveis digitais por fóton¹⁹, é dado pela inclinação de uma intensidade versus variação parcela para uma fonte de luz com intensidade constante (sem flutuações temporais). O fator γ está relacionado à forma do volume de detecção de pixels. De acordo com Hassler et al.^32,o fator γ é igual a 0,3 para imagens TIRF trabalhando no ganho máximo da câmera de detecção¹⁹. Os parâmetros de deslocamento, S e G são características da câmera e do microscópio. O brilho aparente, B, é obtido reorganizando eq. 11 de acordo com eq. 12 e 13:

Experimentalmente, o ε é uma função complexa da intensidade do laser e da eficiência de detecção do sistema. No entanto, uma vez que B / S é linearmente dependente de ε, só é importante determinar o valor relativo do ε para um determinado modo de detecção:

onde o ε' é proporcional ao ε. Ainda assim, uma calibração é realizada usando uma referência interna.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Dia 1. Células HeLa semente em meio completo em uma concentração de 100.000-200.000 células / mL em pratos de fundo de vidro. Sementes 6-8 replicar pratos.
   Nota: Neste exemplo, o meio é complementado com 10% de calor inativado Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM piruvado de sódio, 100 U/100 μg penicilina/estreptomicina. Vários pratos de replicar são preparados.
2. Dia 2-3. Quando as células estão em sub-confluência, transfect metade dos pratos com o plasmídeo de proteína e a segunda metade com plasmídeos de referência (monomer e dimer), em meio livre de soro.
   Nota: A transfecção é feita em meio livre de soro complementado com antibióticos, 0,1% De Soro Bovi Albumin e 25 mM HEPES buffer, sem Fenol Red.
3. Dia 3-4. Verifique se as células transfeccionadas são aderentes ao fundo dos pratos e a membrana celular é fluorescente. Descarte pratos com células cobertas de vegetação ou com fluorescência muito baixa.
   Nota: Não deixe que as células cresçam demais. As células devem ser bem distribuídas e ser aderidas à área de vidro do prato (Figura 1A). Os pratos inferiores de vidro pré-revestidos podem ser usados favorecendo a adesão celular. A cultura celular é testada para contaminação por micoplasma antes de qualquer experimento. Neste exemplo, as células são transfeccionadas com plasmplasmida (A207K)mEGFP-FGFR1 e as células de referência são transfectadas com plasmsiem GPI-(A207K) e plasmplas mEGFP de GPI usando protocolos padrão. Para a microscopia de células vivas, recomenda-se um meio livre de indicadores; 25 mM tampão HEPES é adicionado para evitar alterações de pH durante a imagem.

2. TIRF Imaging - Alinhamento da Linha Laser e Otimização da Iluminação TIRF

1. Quatro horas antes do experimento, ativar a incubadora de temperatura do microscópio em 37 °C.
2. Ligue o microscópio, computadores e câmeras e esperar que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho adequada.
   Nota: A temperatura de trabalho da câmera utilizada neste estudo é de -75 °C.
3. Coloque uma pequena gota de óleo no objetivo. Coloque um prato de amostra no lugar. Feche as portas da incubadora e deixe a temperatura do prato equilibrar (~ 10 min).
4. Ligue a lâmpada de epifluorescência e o laser de 488 nm.
5. Selecione o modo de contraste de epifluorescência para explorar a amostra, pesquisando uma célula para se concentrar no ocular.
   Nota: O uso de uma lâmpada fluorescente para procurar pilhas através do ocular não é imperativo. Uma linha laser apropriada pode ser usada preferivelmente.
6. Selecione o filtro adequado para coletar a emissão verde através da câmera do microscópio (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, ou similar.
7. Mude da porta ocular para a câmera (câmera #1 na Figura 1)no modo epifluorescência, refine o foco e a mudança para o modo TIRF. Os modos epifluorescência e TIRF podem ser nomeados com uma nomenclatura diferente, dependendo da marca do microscópio.
   Nota: Pode haver problemas focando ou alinhando o laser se não houver marcadores fluorescentes na interface coverslip. Para alinhar o laser corretamente (essencial para a boa TIRF), concentre-se no deslizamento de capa. Muitas vezes é muito difícil determinar se o coverslip está em foco. Como sugestão, concentre-se nas bordas das células.
8. Ativar o alinhamento automático seguindo as instruções do microscópio TIRF.
   Nota: Resumidamente, para passos de 2,4 a 2,8, primeiro encontrar as células através do ocular e se concentrar neles, em seguida, enviar a emissão para a porta da câmera do microscópio TIRF, re-foco das células na tela do computador microscópio e ativar o procedimento para o alinhamento a laser. O alinhamento consiste em encontrar o ângulo crítico em que a iluminação se torna evanescente(Figura 3). Microscópios comerciais podem ter protocolos de alinhamento ligeiramente diferentes e também ser totalmente automatizados; outros podem ter uma pequena câmera para facilitar a visualização das condições de ângulo crítico.
9. Escolha uma profundidade de iluminação adequada e otimize a direção do campo evanescente(Figura 3).
   Nota: A profundidade de penetração é mantida constante para todos os controles e amostras.

3. TIRF Imaging: Captura da Série Time

1. Defina uma região de interesse (ROI) de pelo menos 256 x 256 pixels.
   Nota: Nesta configuração, a captura é feita com câmera #2 software que controla diretamente apenas a câmera (Veja a lenda da Figura 1).
2. Defina a exposição a 1 ms e o ganho em EM para 1.000 (este é o fator G no eq. 12 e 13). A tal velocidade, pode ser necessário ajustar ou aumentar a potência laser. Aqui a potência a laser é de 0,5 mW.
   Nota: Dependendo do tipo da câmera e dos limites impostos pelo coeficiente de difusão da proteína, intensidade e fundo de fluorescência, os critérios gerais para definir a potência laser não são para saturar o detector, minimizar o clareamento de fotos e capturar como rápido possível em um S/N razoável. O ganho EM é sempre definido no máximo da câmera (ver Introdução).
3. Executar uma primeira seqüência de teste em condições iniciais e estima aproximadamente o valor S / N. As condições são aceitáveis em S/N = 2-3 ou superior, medida no primeiro quadro da série de primeira vez.
4. Use o controle deslizante do sistema de divisão de emissões que conecta a câmera #2 ao microscópio para mascarar um lado da imagem (Figura 1B, Figura 4A-B)
   Nota: Neste conjunto, um conector de imagem multicanal é instalado na câmera #2 para permitir a aquisição de duas imagens espacialmente idênticas simultaneamente. O sistema é equipado com slides para a montagem de diferentes filtros de emissão. Um dos controles deslizantes monta uma máscara preta para cobrir um lado da imagem. A área mascarada é usada para a calibração interna de cada série de tempo, para determinar os parâmetros da câmera (eq. 12 e eq. 13). Desta forma, não há necessidade de uma etapa de calibração independente e, importante, calibração é realizada em paralelo com a captura de cada série de tempo. Na ausência deste sistema, a câmera pode ser calibrada aplicando protocolos publicados^33.
5. Selecione a opção de autosave do arquivo da câmera.
6. Comece a aquisição da série de imagens. Adquirir um mínimo de 700 quadros em uma relação Mínima S / N de 2.
   Nota: O número de quadros necessários para análise depende da estabilidade da amostra para o fotobranqueamento e da dispersão dos dados. Portanto, a qualidade de cada série de tempos é avaliada durante a análise de N&B.
7. Sem tirar o prato do microscópio, adicione o ligand.
8. Selecione uma célula com uma membrana de fluorescência brilhante e comece rapidamente a primeira série da corrida cinética.
   Nota: Se a adição do ligand é feito rapidamente, esta primeira captura define o ponto = 0 tempo da cinética ligand. O software registra a hora exata da captura.
9. Pesquise uma segunda célula e adquira o segundo ponto de encontro da cinética.
   Nota: As rotinas de visita ao ponto estão disponíveis em alguns microscópios equipados com estágios motorizados x,y,z. Estes permitem a memorização de múltiplas posições no prato celular, e pode ajudar a manter um intervalo mais constante de tempo entre a imagem-série em diferentes células.
10. Capture uma nova célula para cada ponto de tempo da corrida cinética.
    Nota: Após a captura, uma célula é parcialmente fotobranda e não pode ser re-imagem. Por causa disso, a cinética é obtida acombinando séries de tempo de muitas células, cada uma capturada em um momento diferente.
11. Para cada novo prato, repita o protocolo do passo 2.3 para 3.9.
    Nota: Para pratos de referência, adicione um volume do veículo (PBS complementado com 0,01% de albumina de soro bovina) equivalente ao usado para o ligand.

4. Número e Brilho (N&B): Verificação de qualidade da Série Time

1. Converter e salvar como . TIFF os arquivos adquiridos com o software da câmera (.sif arquivos neste exemplo).
2. Importação. Tiff arquivos na rotina de software de análise, ativando a interface gráfica do usuário N & B (GUI) MATLAB.
   Nota: Uma rotina de N&B executável matlab personalizada é usada aqui (análise de N&B na https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Abrindo um importado. O arquivo TIFF, a rotina gera a imagem de intensidade média, o perfil de intensidade média e permite inspecionar a série quadro a quadro(Figura Suplementar 1). Outros softwares estão disponíveis para análise de N&B (por exemplo, software SimFCS).
3. Descartar séries para as quais o perfil de intensidade média mostra mais de 10% de fotobranqueamento, e séries em que houve uma distorção ou tradução evidente da membrana celular durante a aquisição.
4. Os frames de colheita que são evidente fora-de-foco.
   Nota: Uma ferramenta de corte é implementada na rotina para descartar quadros individuais ou múltiplos dentro da série de imagens. Esta operação é permitida porque o tempo quadro-a-quadro não é crítico, enquanto o pixel habitar o tempo (tempo de exposição) é (ver Discussão).
5. Mantenha para a série de análise apenas com pelo menos 500 prazos.

5. Número e Brilho (N&B): Determinação dos Parâmetros da Câmera (Offset, σ e S)

1. Ativar a rotina calibrar câmera.
2. Selecione uma área de pelo menos 20 x 50 pixels na região de ruído do detector(Figura 4).
   Nota: A rotina origina um histograma dos valores (também definido Nível Digital, DL) e retorna um enredo logarithm da Frequência versus Níveis Digitais.
3. No lote de frequência de registro versus nível digital, mova o cursor vermelho linear para delimitar o gaussiano e a parte linear da curva.
   Nota: O cursor vermelho divide as duas seções da curva, e ativa a rotina retornando o deslocamento, que é o centro da função gaussiana da resposta da câmera, o σ do ajuste gaussian, e o fator S, que é a inclinação da parte linear da câmera respons e (Figura 4C-D).

6. Número e Brilho (N&B): Computação dos valores B na Região Selecionada de interesse (ROI)

1. Ativar a chave B.
   Nota: Essa ação gera a imagem de intensidade média(Figura 5,primeira coluna) e a imagem B em que cada valor B individual está associado ao pixel relacionado na imagem(Figura Suplementar 1).
2. Aplique um binning mínimo (2 2) para reduzir a dispersão dos dados e para gerar o histograma B-I (Figura 5,segunda coluna).
   Nota: O histograma B-I representa a distribuição dos valores B de todos os pixels da imagem versus a intensidade do pixel. Y = B/S; X = ( - offset)/S (Figura Suplementar 1 e eq. 11 e 15).
3. Inspecione o histograma B-I usando o cursor quadrado interativo.
4. Selecione um ROI quadrado para a análise(Figura 5,terceira coluna).
   Nota: O cursor sincroniza uma máscara móvel na imagem de intensidade média, destacando os pixels que são selecionados dentro da área do cursor quadrado(Figura Suplementar 1). Por esta inspeção, é possível excluir da análise o fundo e as áreas com intensidade muito baixa.
5. Gerar o mapa B do ROI selecionado (Figura 5,quarta coluna).
6. Salve o arquivo ASCII dos valores B associados à seleção.
7. Importe o arquivo ASCII em um software gráfico para calcular a distribuição de frequência dos dados e obter o valor B médio ± S.E (Figura 5,quinta coluna).
   Nota: Se os dados forem homogêneos, a distribuição de frequência dos valores B aproxima-se de uma distribuição gaussiana.
8. Aplique eq. 15 para derivar o brilho médio = - 1 [((contagens/molécula) por tempo de permanência] para cada célula em cada ponto de tempo da corrida cinética. Normalizar os dados de acordo com:
   
   onde está o valor B médio medido no tempo "t" após adição de ligand, e é o valor B médio medido no momento t=0 (10-20 s após adição de ligand).
   Nota: A normalização dos resultados permite a comparação direta de experimentos realizados em dias diferentes. Compensa diferenças no brilho medido devido ao poder do laser e às flutuações técnicas.
9. Trace o Brilho Médio Normalizado versus tempo de aquisição para construir a corrida cinética (Figura 6).

Resultados

Os resultados de duas células representativas HeLa-mEGFP-FGFR1 semeadas no mesmo prato cultural são mostrados na Figura 5 e na Tabela Suplementar 1. As duas células foram capturadas no tempo 0 min(Figura 5A, superior) e 7 min(Figura 5A, inferior) após a adição do ligand FGF2.

Discussão

A N&B requer várias precauções na escolha do modelo celular e da estratégia de rotulagem. Ele pode ser aplicado apenas para células vivas que permanecem aderidas de forma enova durante o tempo de captura de imagem. Flutuações extras devido ao deslocamento rígido de toda a célula podem ser tratadas com abordagens adequadas de restauração de imagem^38. No entanto, geralmente quando uma célula se move, a membrana celular também se deforma, e a deformação da estrutura, produzindo grande ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections