通过总内部反射荧光显微镜与数量和亮度分析相结合，活细胞中细胞表面受体的显微化动力学

摘要

我们描述了一种成像方法，用于测定由活细胞血浆膜中的配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该协议基于总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜与数字和亮度 （N&B） 分析相结合。

摘要

尽管受体寡聚的重要性和普及性，但很少方法适用于检测聚类事件和测量聚类的程度。在这里，我们描述了一种成像方法，以确定活细胞膜中mEGFP标记受体同质复合物的平均寡聚状态。该协议基于总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜与数字和亮度 （N&B） 分析相结合。N&B 是一种类似于荧光相关光谱 （FCS） 和光子计数直方图 （PCH） 的方法，该方法基于对荧光团荧光强度波动的统计分析，该分析在照明中扩散出来在观察时间内的体积。特别是，N&B是PCH的简化，以获得关于寡聚混合物中蛋白质平均数量的信息。强度波动幅度由荧光的分子亮度和照明体积内的平均荧光量来描述。因此，N&B只考虑振幅分布的第一个和第二个时刻，即平均强度和方差。这同时也是方法的强弱。由于只考虑了两个时刻，N&B无法确定混合物中未知寡聚物的摩尔部分，但它仅估计混合物的平均寡聚状态。然而，只需监测荧光强度的时间波动，即可应用于相对较小的时间序列（与其他瞬时方法相比），以逐像素为基础。它将每像素的有效时间缩短到几微秒，允许在秒到毫秒的时间内采集，这是快速寡头化动力学所必需的。最后，可以探索大细胞区域以及亚细胞隔间。

引言

我们描述了一种总内部反射荧光数和亮度（TIRF-N&B）成像方法，用于确定活细胞血浆膜上受体分子的平均寡聚状态，旨在连接受体组件蛋白质的生物功能动力学（图1）。

在细胞外配体结合时，受体根据其构象、寡聚物、潜在的共受体和膜组成启动细胞内信号转导。尽管受体寡聚的重要性和普及性，在细胞信号1，2，3，4，5，6中被确认为关键^{事件，7、}少数方法可以检测聚类事件，并实验性地测量聚类^{的程度8，9。}共聚焦体积（x，y = 300 nm，z = 900 nm）不足以证明分子相互作用和化学测量，即使在通过图像恢复^算法10进行优化后也是如此。蛋白质寡聚物的亚单位组成不能在纯粹的空间基础上解决，即使超分辨率的方法在x，y分辨率为20-70n....

研究方案

1. 样品制备

1. 第1天。种子HeLa细胞在玻璃底培养皿中，浓度为100，000-200，000细胞/mL。种子6-8复制菜肴。
   注：在此示例中，该介质辅以 10% 热灭活胎儿牛血清 （FBS）、1 mM 丙酸钠、100 U/100 μg 青霉素/链霉素。准备了几道复制菜肴。
2. 第2-3天当细胞处于亚汇合时，在无血清培养基中转染一半与蛋白质粒的菜肴，用参考质粒（单体和二分体）转染一半。
   注：转染是在无血清介质中，辅以抗生素，0.1%牛血清白蛋白和25 mM HEPES缓冲液，不含苯红。
3. 第3-4天检查转染的细胞是否粘附在盘子的底部，并且细胞膜是荧光的。丢弃细胞过度生长或荧光极低的盘子。
   注：不要让细胞过度生长。细胞必须分布良好，并粘附在盘子的玻璃区域（图1A）。预涂玻璃底盘可用于优优细胞粘附。在任何实验之前，细胞培养体都经过支原体污染测试。在此示例中，细胞使用 （A207K） mEGFP-FGFR1 质粒转染，参考细胞使用 GPI-（A207K） mEGFP 和 GPI-（A207K） mEGFP-（A207K） mEGFP 质粒转染。对于活细胞显微镜，建议使用无指标介质;加入25 mM HEPES缓冲液，以防止成像过程中的pH变化。

结果

图5和补充表1显示了同一培养皿中两个代表性的HeLa-mEGFP-FGFR1细胞的结果。在添加FGF2配体后，在0分钟（图5A，上图）和7分钟（图5A，底部）捕获两个细胞。

图5还显示了两个代表性的HeLa细胞的结果，?.......

讨论

N&B 在选择细胞模型和标签策略时需要采取若干预防措施。它只能应用于在图像捕获期间保持稳定粘附的活细胞。由于整个细胞刚性位移引起的额外波动，可以通过适当的图像恢复^方法38来处理。然而，一般当细胞移动时，细胞膜也会变形，结构变形，产生较大的额外方差，对膜蛋白的分析造成严重限制。在这项工作中，荧光结构在HeLa细胞系中表达，因为构成FGFR1可以忽略不计。?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections