Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Summary

Describimos un enfoque de imagen para la determinación del estado oligomérico promedio de los oligómeros receptores etiquetados con mEGFP inducidos por la unión de ligandos en la membrana plasmática de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B).

Abstract

A pesar de la importancia y la ubicuidad de la oligomerización de receptores, pocos métodos son aplicables para detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres. Aquí, describimos un enfoque de imagen para determinar el estado oligomérico promedio de los homocomplejos de receptores etiquetados con mEGFP en la membrana de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B). N&B es un método similar a la espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS) y el histograma de recuento de fotones (PCH), que se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos que se difunden dentro y fuera de una iluminación volumen durante un tiempo de observación. En particular, N&B es una simplificación de PCH para obtener información sobre el número medio de proteínas en mezclas oligoméricas. Las amplitudes de fluctuación de intensidad se describen por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos dentro del volumen de iluminación. Por lo tanto, N&B considera sólo el primer y segundo momento de la distribución de amplitud, a saber, la intensidad media y la varianza. Esta es, al mismo tiempo, la fuerza y la debilidad del método. Debido a que sólo se consideran dos momentos, N&B no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, se puede aplicar a series temporales relativamente pequeñas (en comparación con otros métodos de momento) de imágenes de células en vivo píxel por píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones de tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Reduce el tiempo efectivo por píxel a unos pocos microsegundos, lo que permite la adquisición en el intervalo de tiempo de segundos a milisegundos, lo que es necesario para la cinética de oligomerización rápida. Por último, se pueden explorar grandes áreas celulares, así como compartimentos subcelulares.

Introduction

Describimos un enfoque de imagen de Fluorescencia-Número de Fluorescencia Y Brillo de Reflexión Interna Total (TIRF-N&B) para determinar el estado oligomérico promedio de las moléculas receptoras en la membrana plasmática de las células vivas, con el objetivo de vincular el conjunto del receptor dinámica a la función biológica de las proteínas (Figura 1).

Tras la unión de ligandoextra extracelular, los receptores inician la transducción de la señal intracelular dependiendo de su conformación, oligomerización, posibles coreceptores y composición de la membrana. A pesar de la importancia y ubicuidad de la oligomerización de r....

Protocol

1. Preparación de muestras

1. Día 1. Células HeLa de semillaen en medio completo a una concentración de 100,000-200,000 células / ml en platos con fondo de vidrio. Semilla 6-8 replicar platos.
   NOTA: En este ejemplo, el medio se complementa con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor, piruvato sódico de 1 mM, 100 U/100 g de penicilina/estreptomicina. Se preparan varios platos replicados.
2. Día 2-3. Cuando las células están en subconfluencia, transfectar la mitad de .......

Discussion

N&B requiere varias precauciones en la elección del modelo celular y la estrategia de etiquetado. Solo se puede aplicar a las celdas vivas que permanecen establemente adheridas durante el tiempo de captura de imágenes. Las fluctuaciones adicionales debidas al desplazamiento rígido de toda la celda podrían manejarse con los enfoques adecuados de restauración de imágenes^38. Sin embargo, generalmente cuando una célula se mueve, la membrana celular también se deforma, y la deformación de la e.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections